俞姍姍， 劉 雅， 楊萌萌， 沈祺達(dá)， 謝國強(qiáng)， 王世貴， 唐 斌

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

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褐飛虱在不同水稻品系上繁殖能力及相關(guān)解毒酶系基因表達(dá)變化分析

俞姍姍， 劉 雅， 楊萌萌， 沈祺達(dá)， 謝國強(qiáng)， 王世貴， 唐 斌

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

采用水稻敏感品系TN1和抗性品系中浙優(yōu)、IR56飼養(yǎng)褐飛虱，研究褐飛虱產(chǎn)卵量等繁殖情況，測定解毒酶系中酯酶、細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)及卵黃原蛋白(Vg)等基因在mRNA上的表達(dá)變化.結(jié)果顯示褐飛虱在抗性水稻上產(chǎn)卵量減少，Vg2的表達(dá)量極顯著下降，表明水稻抗性對褐飛虱的產(chǎn)卵量有抑制作用且Vg2調(diào)控產(chǎn)卵.酯酶和P450中的部分基因均在取食抗性水稻的褐飛虱體內(nèi)表達(dá)量較高，存在極顯著差異.

褐飛虱；抗性；解毒酶系；生化反應(yīng)

褐飛虱Nilaparvatalugens，屬同翅目，飛虱科，廣泛分布于南亞、東南亞、太平洋島嶼等地區(qū)，中國各稻區(qū)均有分布[1].褐飛虱是一種為害水稻莖鞘的單食性害蟲，通過口針刺吸稻株韌皮部的汁液對水稻造成直接危害[2-3].該蟲具有繁殖速度快、生命周期短、內(nèi)稟增長率高、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在外界環(huán)境適宜時(shí)極易引發(fā)災(zāi)害，造成水稻的巨大損失[4].由于化學(xué)防治會(huì)產(chǎn)生成本高、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量超標(biāo)、農(nóng)田環(huán)境污染以及違背自然規(guī)律等副作用，科學(xué)家將目光轉(zhuǎn)向?qū)λ究瓜x性的研究.大量實(shí)踐表明利用抗性品系是防治褐飛虱最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的手段.本實(shí)驗(yàn)選用TN1(感蟲系)、中浙優(yōu)(測試系)和IR56(抗蟲系)3種水稻品系研究不同水稻對褐飛虱的抗性，探索褐飛虱的反防御作用.通過分析褐飛虱在不同抗性水稻上的生化指標(biāo)變化，研究褐飛虱對不同水稻品系的作用，從而為培育新抗逆品系的水稻奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試水稻

敏感品系TN1、抗性品系中浙優(yōu)及IR56種子由中國水稻研究所提供.水稻苗在人工氣候箱中培育，溫度(25±1) ℃、相對濕度(70±5)%、光強(qiáng)10 000 lux、光周期14 L∶10 D.

1.1.2 供試?yán)ハx

褐飛虱來自本實(shí)驗(yàn)室長期飼養(yǎng)種群.飼養(yǎng)方法為：取TN1水稻大苗，修剪枝葉，保留水稻稈，用濕棉花包扎根部，將其放入透明玻璃管(深度×管口直徑為250 mm×30 mm)內(nèi).將褐飛虱接到水稻苗上，放入人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置溫度(25±1) ℃、相對濕度(70±5)%、光強(qiáng) 10 000 lux、光周期14 L∶10 D.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同水稻品系上褐飛虱的產(chǎn)卵量

將供試稻苗根部用脫脂棉包裹，浸水稻培養(yǎng)液，置于透明玻璃管(深度×管口直徑為250 mm×30 mm)中，接入處于孕期的褐飛虱(羽化后3 d)，每管5頭.用紗布封口，以防止試蟲逃逸，將試管置于人工氣候箱內(nèi)，條件同1.1.2.每天按時(shí)更換新鮮水稻苗，并在解剖鏡下觀察產(chǎn)卵痕，記錄落卵量.移出的成蟲接入到試管內(nèi)相應(yīng)的新水稻苗上，飼養(yǎng)至死亡，每天記錄產(chǎn)卵量.

1.2.2 褐飛虱總RNA的抽提(Trizol法)

取9管1.5 mL離心管，分別取取食TN1、中浙優(yōu)、IR56水稻7 d的褐飛虱各3管，每管5～10頭；將離心管置于冰上，每管加入100 μL Trizol，電動(dòng)勻漿器充分研磨；補(bǔ)足Trizol至1 mL，用力振蕩3 min，室溫靜置8 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置20 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min；輕輕倒去上清液，加入1 mL 75%的乙醇，將沉淀吹離管壁，洗滌沉淀；4 ℃，7 500 r/min離心5 min；輕輕倒去上清液，將離心管倒置在超凈臺(tái)3～5 min，用移液器吸出多余液體，加入30～50 μL DEPC處理水溶解沉淀，吹倒混勻；各取1 μL RNA分別用于超微量核酸蛋白測定儀濃度檢測和電泳檢測.

1.2.3 褐飛虱抗性基因的篩選

參考相關(guān)文獻(xiàn)，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期測定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出合適的CYP6、CYP4等P450基因家族[5-8]、酯酶基因家族、卵黃原蛋白[9-10]等基因作為mRNA水平檢測的備選靶標(biāo)基因.

1.2.4 褐飛虱抗性基因的引物設(shè)計(jì)與合成

選擇actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)抗性基因的篩選，確定NLGST、NLAChE1、NLAChE2、CYP6CW1、CYP417A1、NLVg2、NLVg1這7個(gè)基因?yàn)楹诛w虱抗性基因，利用DNA Star和PrimerPrimer5軟件設(shè)計(jì)定量引物，引物除遵循普通引物的設(shè)計(jì)原則外，3’端還需避開T及需要在整個(gè)基因序列中檢索它的特異性，具體見表1.擴(kuò)增片段長度均在100～250 bp間，引物由上海Invitrogen公司合成.

表1 褐飛虱7個(gè)基因和actin的引物序列

1.2.5 cDNA第一鏈的合成

首先利用NanoDropTM2000測定抽提的總RNA濃度，根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 反應(yīng)體系計(jì)算需加入的RNA 體積，然后根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA 第一鏈的反轉(zhuǎn)錄.

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)前先對引物(表1)進(jìn)行特異性、濃度和退火溫度的摸索，得到最適溫度和最適量.每管cDNA做3個(gè)定量重復(fù)孔.實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，然后55～60 ℃退火延伸25 s(循環(huán)40次，不同引物最適Tm值不同)；最后繪制65～95 ℃溶解曲線.通過定量PCR測定出6個(gè)基因的CT值，每管樣品的3個(gè)重復(fù)孔取平均值用于計(jì)算.每次樣品有3組數(shù)值，即最后得到的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤.再通過2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算，公式為：2-△△CT= 2-[(CT對照組-CT對照actin)- (CT待測組-CT待測組actin)](對照組為TN1水稻上褐飛虱的CT值).

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

Excel整理數(shù)據(jù)，利用SPSS13.0進(jìn)行方差分析并用Ducan法進(jìn)行多重比較，最后用SigmaPlot10.0作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻品系上褐飛虱的產(chǎn)卵量

3種不同水稻品系中，褐飛虱在TN1上每天產(chǎn)卵多且比較均勻，而在中浙優(yōu)上顯示為先下降后上升的趨勢，IR56品系上褐飛虱的產(chǎn)卵量呈下降趨勢(圖1A).統(tǒng)計(jì)總產(chǎn)卵量顯示IR56水稻上褐飛虱總產(chǎn)卵量極顯著低于中浙優(yōu)和TN1水稻(P<0.01)(圖1B).

圖1 不同水稻品系上褐飛虱的產(chǎn)卵量Fig. 1 The fecundity of Nilaparvata lugens in different rice lines

2.2 褐飛虱體內(nèi)Vg蛋白的表達(dá)分析

卵黃原蛋白是雌蟲特有的蛋白，以取食TN1水稻的褐飛虱體內(nèi)Vg1的表達(dá)量為基準(zhǔn)，取食中浙優(yōu)、IR56的褐飛虱體內(nèi)Vg1的表達(dá)量分別為在TN1上取食的1.91、6.88倍，IR56上的表達(dá)量顯著高于中浙優(yōu)(圖2).但取食中浙優(yōu)和IR56的褐飛虱體內(nèi)Vg2的表達(dá)量僅占取食TN1的褐飛虱的27.40%和2.10%.

圖2 褐飛虱體內(nèi)Vg蛋白的表達(dá)量Fig. 2 The expression quantity of Vg proteins in Nilaparvata lugens

圖3 褐飛虱體內(nèi)酯酶、P450和GST的表達(dá)量Fig. 3 The expression quantity of esterase,P450 and GST in Nilaparvata lugens

2.3 褐飛虱體內(nèi)酯酶、P450和GST表達(dá)分析

不同的水稻品系能夠影響褐飛虱體內(nèi)的代謝酶系和海藻糖代謝酶系在mRNA水平上的表達(dá).以取食TN1褐飛虱體內(nèi)的相關(guān)基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，研究結(jié)果表明褐飛虱取食IR56抗性品系后NLAChE2、CYP417A1的表達(dá)量極顯著高于取食中浙優(yōu)水稻后的表達(dá)量(P<0.01)，且取食中浙優(yōu)水稻的褐飛虱體內(nèi)的表達(dá)量分別為取食TN1水稻的褐飛虱的243.12和47.78倍(圖3).取食IR56和中浙優(yōu)水稻的褐飛虱NLAChE1、CYP6CW1和NLGST表達(dá)量均低于取食TN1水稻的表達(dá)量.取食IR56的褐飛虱體內(nèi)NLAChE1、CYP6CW1和NLGST表達(dá)量僅占取食TN1的褐飛虱的10.10%、52.33%和97.20%.

3 討 論

根據(jù)已有研究，不同品系的水稻體內(nèi)存在的物質(zhì)有一定的差距[5，11]，對褐飛虱繁殖產(chǎn)生的影響也不相同[12-14].本實(shí)驗(yàn)中褐飛虱在IR56水稻上的產(chǎn)卵量總體上最少，中浙優(yōu)次之，水稻品系抗性與其上褐飛虱的產(chǎn)卵量呈負(fù)相關(guān)，這與羅海平[15]的研究結(jié)果一致，表明水稻抗性對褐飛虱的產(chǎn)卵量有抑制作用.

為研究褐飛虱在不同抗性水稻中的基因表達(dá)差異，筆者以TN1水稻為對照組，通過熒光定量PCR檢測卵黃原蛋白、乙酰膽堿酯酶、細(xì)胞色素P450和GST的表達(dá)量.卵黃原蛋白是雌蟲特有的蛋白，主要在脂肪體中合成，而后運(yùn)輸?shù)缴L的卵母細(xì)胞中[16-17].卵黃原蛋白不是一種單一形式的蛋白，而是由若干基因編碼的相關(guān)蛋白組成的一個(gè)家族.它不僅可為正在發(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、糖水化合物、磷和硫等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)，還能促進(jìn)培養(yǎng)中的動(dòng)物卵母細(xì)胞的生長和分化[18].本實(shí)驗(yàn)中，取食抗性水稻中浙優(yōu)和IR56的褐飛虱體內(nèi)NLVg1的表達(dá)量顯著上升，推測可能是褐飛虱對抗性水稻適應(yīng)的結(jié)果；而取食中浙優(yōu)和IR56的褐飛虱體內(nèi)NLVg2的表達(dá)量下降，結(jié)合褐飛虱產(chǎn)卵量研究，說明NLVg2對褐飛虱的產(chǎn)卵量有調(diào)控作用.酯酶是能水解內(nèi)源和外源酯類化合物的所有酶的通稱，是一類能催化裂解酯鍵的水解酶, 主要作用是解毒、分解外源有毒有害物質(zhì).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在取食兩種抗性品系水稻的褐飛虱體內(nèi)NLAChE1表達(dá)顯著低于敏感品系，而NLAChE2表達(dá)量卻極顯著高于敏感品系.這表明，不同酯酶基因在褐飛虱適應(yīng)不同水稻品種過程中可能有著不同的作用，即褐飛虱酯酶對水稻寄主的適應(yīng)是不同酯酶基因綜合作用的結(jié)果，這與郭燕[19]的研究結(jié)果一致.酯酶類型多樣，抗性品系對其產(chǎn)生的影響可能有所不同[20].細(xì)胞色素單氧化酶P450為一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超家族，它參與內(nèi)源物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝，與昆蟲的發(fā)育相關(guān).相關(guān)文獻(xiàn)表明P450酶系介導(dǎo)的外源解毒是由相應(yīng)的P450基因表達(dá)增強(qiáng)造成的.昆蟲可以利用P450對植物毒素進(jìn)行代謝解毒，以植物代謝中間物為原料合成自身活性物質(zhì).相關(guān)研究表明，用抗性水稻飼養(yǎng)褐飛虱后，CYP6AX1、CYP6AY1、CYP6CW1和CYP6CS1基因在褐飛虱中腸表達(dá)明顯上調(diào)，表明這些基因在褐飛虱抵抗抗性水稻中發(fā)揮了重要作用[21].本研究結(jié)果顯示P450酶系中的CYP417A1在取食中浙優(yōu)與IR56的褐飛虱體內(nèi)表達(dá)量極顯著上升，且存在極顯著差異(圖3)，由此說明CYP417A1在褐飛虱抵抗抗性水稻中有重要的作用.而另一個(gè)P450基因CYP6CW1的表達(dá)在抗性品系中降低，中浙優(yōu)與TN1比較存在極顯著差異，這可能與檢測時(shí)褐飛虱取食后的時(shí)間太長有關(guān).谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)是一類分布于生物體的多功能酶系，通過運(yùn)輸或代謝外源和內(nèi)源的化合物如激素、植物次生化合物、殺蟲劑等，對機(jī)體的解毒、激素調(diào)控、抗氧化等具有重要的作用[22-24].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明取食敏感品系與抗性品系水稻的褐飛虱，其體內(nèi)GST的表達(dá)無顯著差異，說明水稻抗性對褐飛虱體內(nèi)GST的影響不大，其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究.

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褐飛虱在抗性水稻上的產(chǎn)卵量和Vg2的表達(dá)量相對于敏感品系明顯減少，水稻抗性抑制褐飛虱的產(chǎn)卵并且Vg2調(diào)控褐飛虱產(chǎn)卵.取食抗性水稻的褐飛虱體內(nèi)Vg1的表達(dá)量顯著上升，推測可能是褐飛虱對抗性水稻適應(yīng)的結(jié)果.取食抗性水稻的褐飛虱其體內(nèi)的NLAChE1表達(dá)量顯著低于敏感品系，而NLAChE2表達(dá)量顯著高于敏感品系，表明褐飛虱乙酰膽堿酯酶對水稻寄主的適應(yīng)是不同酯酶基因綜合作用的結(jié)果.細(xì)胞色素P450中CYP417A1在取食抗性水稻的褐飛虱體內(nèi)表達(dá)量極顯著上升，表明其在褐飛虱抵抗抗性水稻中發(fā)揮了重要作用.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在褐飛虱抗性上也有一定的作用，但其機(jī)制有待研究.這些研究結(jié)果為探究褐飛虱抵抗不同抗性水稻品系的生理和分子機(jī)理提供了理論依據(jù)，也為培育良好的抗性水稻抵抗褐飛虱危害奠定基礎(chǔ).

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On the Fertility and Related Detoxification Enzyme Systems Gene Expression ofNilaparvatalugensFeeding on Different Rice Varieties

YU Shanshan, LIU Ya, YANG Mengmeng, SHEN Qida, XIE Guoqiang, WANG Shigui, TANG Bin

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

This experiment adopts the TN1 sensitive rice varieties and other different levels of resistance rice cultivars, such as Zhongzheyou and IR56, to breedN.lugens, and then use a part of thoseN.lugensto studyN.lugensspawning and other breeding situations, and determines the expression changes of esterase, cytochrome P450, Glutathione transferase(GST), vitellogenin(Vg) on mRNA. The results show that the fecundity ofN.lugensreduces on resistance rice, and the expression of Vg2 decreases significantly, which indicates resistance rice has inhibitory effect onN.lugensfecundity and Vg2 regulate the spawning. Part genes of esterase and P450 have high expression in the resistance riceN.lugensbody, which have significant differences.

Nilaparvatalugens; resistance; detoxification enzymes; biochemical responses

2016-04-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371996)；杭州市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(20140432B01)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2015R423043)；杭州師范大學(xué)“本科生創(chuàng)新能力提升工程”計(jì)劃項(xiàng)目(CX2014088).

唐 斌(1980—)，男，副研究員，博士，主要從事昆蟲生理生化與分子生物學(xué)及植物害蟲生物防治研究.E-mail:tbzm611@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2016.06.007

S435.112+.3

A

1674-232X(2016)06-0595-05