童 芬，謝登峰，曾心美，何興金

(四川大學 生命科學學院 生物資源與環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610064)

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四川牡丹和圓裂四川牡丹遺傳多樣性的ISSR分析

童 芬，謝登峰，曾心美，何興金*

(四川大學 生命科學學院 生物資源與環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610064)

利用9條ISSR引物對四川牡丹(Paeoniadecomposita)5個居群和圓裂四川牡丹(Paeoniadecompositasubsp.rotundiloba)4個居群的遺傳多樣性進行了初步檢測。結果表明：(1)四川牡丹在物種水平上的多態(tài)位百分率(PPB)為89.36%，Nei’s基因多樣度(H)為0.291 4，Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)為0.441 3；圓裂四川牡丹在物種水平上的多態(tài)位百分率(PPB)為81.91%，Nei’s基因多樣度(H)為0.285 7，Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)為0.428 5；圓裂四川牡丹的各項多樣性參數(shù)略低于四川牡丹，而且居群水平上，四川牡丹與圓裂四川牡丹的遺傳多樣性相對較低。(2)四川牡丹和圓裂四川牡丹居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)分別為0.355 5和0.379 1，2個物種居群內(nèi)的遺傳分化都大于居群間的遺傳分化；這2個物種居群間的基因流(Nm)非常有限，其中四川牡丹為0.906 5，圓裂四川牡丹為0.819 0。(3)經(jīng)Mantel檢測，四川牡丹居群間遺傳距離與地理距離具有顯著正相關關系(r=0.776，P=0.01)，而圓裂四川牡丹則不存在顯著相關性(r=-0.344，P=0.402)。(4)UPGMA聚類結果顯示，四川牡丹與圓裂四川牡丹在分子水平上出現(xiàn)了明顯分化，二者為相互獨立的物種。研究表明，四川牡丹受到的人為干擾和自然災害是其瀕危的重要原因，與四川牡丹相比，圓裂四川牡丹居群受到的破壞更為嚴重；建議及時就地保護四川牡丹和圓裂四川牡丹居群的所有個體，而在遷地保護時，因遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，應盡可能大量采樣，達到最大限度保存其遺傳多樣性的目的。

四川牡丹；圓裂四川牡丹；遺傳多樣性；ISSR

四川牡丹(Paeoniadecomposita)和圓裂四川牡丹(Paeoniadecompositasubsp.rotundiloba)隸屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)。四川牡丹是多年生落葉小灌木，花期4～5月，果期8月；野生居群分布在四川西北部的金川大渡河一帶，其分布區(qū)干旱少雨，溫差較大，在陽坡灌木叢中常見，少見于林內(nèi)。四川牡丹也是中國特有的珍稀瀕危物種，1992年被列為國家二級保護植物[1]。而圓裂四川牡丹則分布在四川西北部岷江流域的黑水、松潘、理縣、茂縣等地，花果期同四川牡丹，在海拔1 600～2 700 m都有分布，其生長環(huán)境大多是灌木叢中或林下。其瀕危級別目前還未有相關文章報道。

四川牡丹和圓裂四川牡丹兩者在形態(tài)上十分相似，根據(jù)《Flora of China》的描述，它們的差別主要在于心皮數(shù)、頂端小葉形狀及頂端裂片的長寬比不同。四川牡丹的心皮數(shù)大多5枚，頂端小葉橢圓形到卵形；圓裂四川牡丹心皮數(shù)3(或2)或4(或5)枚，頂端小葉卵形到卵圓形(圖1)。在較早時期只記錄有四川牡丹，1997年，洪德元先生根據(jù)形態(tài)特征的差異，劃分出其亞種圓裂四川牡丹[2]，隨后又根據(jù)分子方面證據(jù)將圓裂四川牡丹確立為一個獨立的種[3]。前人的研究主要集中于四川牡丹，包括分類學[4-5]、生態(tài)學[6]、遺傳學[7]、種子萌發(fā)[8-9]、生理生化等方面[10-11]，而對圓裂四川牡丹的研究僅僅涉及到其系統(tǒng)進化方面[12]。牡丹雍容華貴，不僅具有極高的觀賞價值，更有巨大的藥用價值[13]；四川牡丹作為牡丹的一個重要品種，是可貴的栽培資源，現(xiàn)已被引種至河南洛陽、重慶墊江、甘肅天水等地[14]；此外，四川牡丹在油用牡丹生產(chǎn)與育種上也具有很大的開發(fā)價值[15]。然而作為一種具有重要的觀賞和應用價值的物種，其生境已經(jīng)受到人為和自然的嚴重破壞，如采挖、放牧、土地利用、滑坡等，這些都嚴重危及到它們的生存環(huán)境，對野生居群的保護和管理迫在眉睫。

擁有足夠多的遺傳變異性能讓一個物種適應環(huán)境條件改變而產(chǎn)生的新的選擇壓力，這樣一個物種才能長期存活繁衍下去[16]。因此，檢測遺傳結構能夠幫助我們評估一個物種能否長期存活下去并且是制定保護策略的第一步。ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記又被稱作簡單重復序列多態(tài)性擴增，有樣品用量少、快速靈敏和成本低等優(yōu)點，且穩(wěn)定性高、實驗重復性好[17-18]，近年來被廣泛運用[19-21]。本研究采用ISSR技術分析四川牡丹5個居群和圓裂四川牡丹4個居群的遺傳多樣性，以闡明它們的遺傳結構和遺傳多樣性水平，雖然圓裂四川牡丹沒有列入瀕危名錄，但希望通過該研究予以重視，加強保護，為科學制定保護策略提供依據(jù)。

圖1 四川牡丹和圓裂四川牡丹形態(tài)(花期與果期)Fig.1 The morphology of P. decomposita and P. decomposita subsp. rotundiloba(flowering and fruiting stage)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

從國家標本平臺和中國數(shù)字植物標本館查詢獲得四川牡丹和圓裂四川牡丹分布信息。2015年5～6月野外采集樣品材料(表1，圖2)，本研究的樣品按照居群采樣，為避免居群內(nèi)個體被重復取樣，個體間相距10 m以上。因為居群較小，每個居群取樣數(shù)5～16個個體不等。野外采集的植株幼嫩葉片，放于硅膠中及時干燥待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 ISSR引物篩選和PCR擴增 取葉片1～2片，用植物基因組DNA試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，紫外分光光度法檢測DNA的質量濃度，最后稀釋標定到20 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

所用引物購自華大基因有限公司，源自于哥倫比亞大學University of British Columbia(簡稱UBC大學)公布的100條ISSR引物。通過查閱四川牡丹及其近緣科屬ISSR-PCR實驗的相關文獻，初步篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物9條(表 2)。從每個居群中隨機抽選1個樣品對這9條引物進行退火溫度及擴增條件的優(yōu)化實驗。PCR擴增體系為20 μL，其中含3 μL DNA，引物1 μL，混合MIX(購自康為公司)10 μL，不足的用ddH2O補齊。PCR反應程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，47～57 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物以DL2000作為分子量標準，用含有Gold View的1.5%瓊脂糖凝膠于120 V恒壓電泳80 min。電泳結束后用凝膠成像系統(tǒng)儀(Bio-Rad GelDocXR+imaging system)進行拍照保存。

居群編號同表1圖2 四川牡丹和圓裂四川牡丹的實地(中國四川)采樣分布圖Population codes are given in Table 1Fig.2 The distribution of the samples in Sichuan of China

引物Primer引物序列Sequenceofprimer退火溫度Annealingtemperature/℃UBC807(AG)8T50UBC810(GA)8T51UBC811(GA)8C50UBC812(GA)8A50UBC835(AG)8YC48.9UBC840(GA)8YT49UBC844(CT)8RC50.7UBC866(CTC)651UBC873(GACA)453

Note: Y =C/T; R=A/G

表1 四川牡丹和圓裂四川牡丹居群的地理位置和采樣數(shù)

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 電泳結果根據(jù)DL2000(由康為公司提供DNA Marker)判讀擴增條帶的有無及大小，同一位點有條帶賦值“1”，無條帶賦值“0”。采用Excel軟件對電泳結果進行數(shù)據(jù)轉化，構建0/1數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE1.32[22]軟件對數(shù)據(jù)進行分析獲得所需的多態(tài)性位點等遺傳參數(shù)，包括多態(tài)位百分率(PPB)、基因多樣性(H)、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)、平均每個位點上的觀察等位基因數(shù)(Na)、平均每個位點的有效等位基因(Ne)、總基因多樣度(Ht)、居群內(nèi)的基因多樣度(Hs)、居群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)、居群間的基因流(Nm)，Nei’s遺傳距離(D)和遺傳一致度(Hi)[23-25]；運用NTSYSpc2.1軟件進行UPGMA法聚類分析，構建樹狀圖[26]。同時采用AMOVA1.55[27]軟件分析遺傳變異在居群內(nèi)及居群間的分布情況。運用TFPGA1.3軟件進行Mantel檢測[28]，檢測居群之間的遺傳距離與地理距離之間的關系。為了揭示居群之間的遺傳差異及相關性，使用STRUCTUREv2.3軟件[29]計算四川牡丹和圓裂四川牡丹居群的遺傳結構。軟件參數(shù)設置為：burn-in，5×104；MCMC，105。并進行6次隨機運算(K值設置為2 ～ 8)。

2 結果與分析

2.1 2類牡丹的遺傳多樣性

用篩選出的9條引物(表2)對居群進行PCR擴增，所得片段在100～2 000 bp之間，共擴出94條清晰可重復的條帶，其中多態(tài)性條帶四川牡丹84條，圓裂四川牡丹77條。結果(表3)顯示：在居群水平上，四川牡丹各居群的PPB范圍為41.49% ～ 62.77%，平均值為51.06%，表明四川牡丹居群的遺傳多樣性并不是很低。在物種水平上，四川牡丹的遺傳多樣性PPB=89.36%，Ne=1.493 9±0.352 5，H=0.291 4±0.170 7，I=0.441 3±0.226 5。假設種群處于Hardy-Weinberg平衡，5個居群平均有效等位基因為1.321 4，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.187 1，各參數(shù)均略低于物種水平。Shannon多樣性信息指數(shù)顯示了各居群遺傳變異由高到低依次是金川曾達、丹巴、金川觀音橋、康定、馬爾康，與PPB值分析一致，居群間遺傳多樣性參數(shù)與四川牡丹類似，圓裂四川牡丹遺傳多樣性水平在物種和居群兩個水平表現(xiàn)不同(表3)。圓裂四川牡丹在居群水平上各個居群的PPB為32.98% ～ 63.83%，平均值為45.75%。其中多態(tài)位點最高的是黑水居群為63.83%，而理縣居群的最低。在物種水平上，圓裂四川牡丹的PPB、Ne、H和I分別是81.91%、1.485 4±0.352 5、0.285 7±0.178 2和0.428 5±0.246 1。同樣假設種群處于Hardy-Weinberg平衡，4個居群的平均有效等位基因為1.303 4，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.174 0。Shannon多樣性信息指數(shù)顯示了各居群的遺傳變異由高到低依次是黑水、茂縣、松潘、理縣，Shannon多樣性信息指數(shù)與PPB結果一致，黑水居群遺傳變異最大。

表3 2類牡丹的遺傳多樣性

注：居群編號同表1;Na.等位基因觀測值；Ne.有效等位基因；H. Nei’s基因多樣性；I. Shannon’s指數(shù)；PPB.多態(tài)位百分率

Note: Population codes are identical to Table 1;Na. Observed number of alleles;Ne. Effective number of alleles;H. Nei’s gene diversity;I. Shannon’s information index;PPB. Percentage of polymorphic loci

Ne最大值為(1.397 1±0.383 3)，最小值為(1.257 2±0.351 8)；H最大值為(0.228 7±0.206 2)，最小值為(0.150 9±0.195 6)。表明四川牡丹居群之間存在一定的遺傳差異。

2.2 2類牡丹的遺傳分化與基因流

用POPGENE1.32算出四川牡丹5個居群Ht為0.289 4，Hs為0.186 5，Gst為0.355 5(表4)，即有35.55%的變異存在于居群間，居群內(nèi)的變異則占64.45%，居群內(nèi)的遺傳分化大于居群間的分化，且居群間基因交流程度低(0.906 5)。利用AMOVA1.55軟件分析表明，在總的遺傳變異中，有67.43%變異發(fā)生在居群內(nèi)(P<0.001)，32.57%的變異在居群間(表5)，與POPGENE分析的結果一致，均表明遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。

同樣，POPGENE1.32計算出圓裂四川牡丹4個居群Ht為0.280 1，Hs為0.173 9，Gst為0.379 1，Nm為0.819 0(表4)，基因流小于1，表明居群間基因流少，居群間遺傳分化系數(shù)為0.379 1，遺傳變異主要存在居群內(nèi)。AMOVA分析結果顯示(表5)，總變異中34.75%的變異在居群間，表明居群間存在一定程度的遺傳分化。

2.3 2類牡丹聚類分析

根據(jù)POPGENE計算得出的結果，四川牡丹5個居群兩兩居群的Nei’s遺傳一致度(Hi)范圍為0.772 4～0.93 21，遺傳距離(D)范圍為0.070 3～0.258 3(表6)。

四川牡丹5個居群Nei’s遺傳距離都較小，表明地理親緣很近。金川曾達(ZD)和金川觀音橋(GYQ)的遺傳一致度最高(Hi=0.932 1)且遺傳距離最近(D=0.070 3)，聚類分析中也聚在一起；康定(KD)和馬爾康(MEK)居群的遺傳一致度最低(Hi=0.772 4)，遺傳距離最遠(D=0.258 3)，在UPGMA聚類分支中也最遠。四川牡丹的Mantel檢測揭示居群間地理距離和遺傳距離呈正相關(r=0.776，P=0.01)，表明居群間有地理上的隔離。

表4 2類牡丹居群多樣性Nei’s分析

注：Ht. 總基因多樣性；Hs。居群內(nèi)基因多樣性；Gst. 基因分化系數(shù)；Nm. 基因流

Note:Ht.Total gene diversity;Hs. Gene diversity within population;Gst. Coefficient of gene differentiation;Nm. Gene flow,Nm=0.5(1-Gst)/Gst[30].

表5 2類牡丹的AMOVA分析

注：*P值表示比觀察值的變異大的概率，該概率是通過把居群中的樣本經(jīng)過1 000次隨機排列改變計算得到的

Note: *P-values are the probabilities of having a more extreme variance component than the observed values alone, probabilities were caleulated by 1 000 random permutations of individuals across populations

表6 2類牡丹居群的Nei’s遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)

用NTSYS軟件對圓裂四川牡丹4個居群進行UPGMA聚類分析(圖3)，松潘(SP)和茂縣(MX)居群遺傳一致度最高，遺傳距離最近，首先聚在一起，而后與黑水居群聚為一支。Mantel分子檢測表明圓裂四川牡丹居群的遺傳距離和地理距離呈負相關(r=-0.344，P=0.402)。

POPGENE軟件計算出四川牡丹和圓裂四川牡丹居群種間總基因多樣度為0.351 9，居群內(nèi)基因多樣度為0.180 9，遺傳分化系數(shù)為0.485 9。說明遺傳變異基本存在居群內(nèi)。四川牡丹和圓裂四川牡丹種間基因流為0.529 1，表明兩個種之間的基因交流水平較低;種間分析結果(表5)顯示，兩個種間的變異百分率是22.01%，小于種內(nèi)居群間的變異(26.14%)。Mantel檢測顯示地理距離和遺傳距離呈正相關關系(r=0.473，P=0.01)，存在隔離，聚類分析結果也支持兩者是獨立的物種。

基于Nei’s遺傳距離的主成分分析中(圖4)，大體分為兩組，四川牡丹為一組，圓裂四川牡丹為另一組；種內(nèi)的分組為：四川牡丹的康定和丹巴居群為一組，金川曾達、金川觀音橋、馬爾康居群為一組；圓裂四川牡丹的黑水、松潘、茂縣居群為一組，理縣居群單獨為一組，與UPGMA聚類分析結果基本一致。STRUCTURE軟件基于貝葉斯聚類分析顯示當K=2時是最合適的分組(圖5)，即四川牡丹居群為一組，圓裂四川牡丹居群為另一組。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存、發(fā)展、進化的基礎[31]。許多研究表明狹域分布的物種或者瀕危的物種仍保留著較高的遺傳多樣性，例如，與四川牡丹同屬的滇牡丹[32]、紫斑牡丹[21]。雖然四川牡丹和圓裂四川牡丹僅狹域分布在四川西北部，但是ISSR分子標記揭示了它們在物種水平上遺傳多樣性較高，分別是89.36%和81.91%，居群水平上的遺傳多樣性也不太低。

居群編號同表1 圖3 2類牡丹居群的UPGMA聚類Population codes are given in Table 1Fig.3 Dendrogram of two tree peonies’ populations

圖4 2類牡丹居群主成分分析Fig.4 Principal coordinate analysis(PCoA) of two tree peonies populations

圖5 基于Structure的兩類牡丹的遺傳結構(K=2)Fig.5 Bayesian model-based clustering (Structure) of two tree peonies(optimal value of K=2)

瀕危物種遺傳多樣性高低與很多因素有關，如繁育系統(tǒng)、生活史特性、分布范圍、基因流、遺傳漂變和自然選擇等[33-34]。普遍認為，繁育系統(tǒng)和種子傳播方式是影響遺傳多樣性高低的主要因素。有研究表明長壽命、異交、廣布種、動物傳播種子都會使物種具有高的遺傳多樣性[35]。該研究中四川牡丹和圓裂四川牡丹所表現(xiàn)出來的遺傳多樣性水平可能歸于繁育系統(tǒng)、種子傳播方式及生活史特性。四川牡丹花朵大，色彩鮮艷，氣味濃，具有明顯的蟲媒傳粉特征，駱勁濤在其傳粉生物研究中發(fā)現(xiàn)四川牡丹的繁育系統(tǒng)以異交為主[36]，而這樣的繁育系統(tǒng)有利于保持高的遺傳多樣性和基因流。牡丹類植物種子主要靠重力傳播[37]，果實成熟后果殼破裂種子散落在母樹周圍，傳播距離有限，而有研究證明靠重力傳播種子的特有種遺傳多樣性偏低[38]，也說明了四川牡丹與圓裂四川牡丹在居群水平上遺傳多樣性相對較低的原因。有文獻記載四川牡丹曾廣泛分布[39]，且四川牡丹和圓裂四川牡丹都是多年生灌木，世代重疊，據(jù)此推測它們的遺傳基礎可能較豐富。盡管它們的繁育系統(tǒng)及生活史特性有一定的抵抗環(huán)境壓力的優(yōu)勢，但是，隨自然(如滑坡、地震)和人為(如采挖、放牧)的干擾而形成了分散的居群，基因交流受到限制，四川牡丹和圓裂四川牡丹仍臨著滅絕的危險。

3.2 遺傳分化

四川牡丹與圓裂四川牡丹種下居群間的Nei’s基因分化系數(shù)Gst分別為0.355 5和0.379 1，與AMOVA分析結果一致，種下居群間出現(xiàn)一定程度的遺傳分化，由此認為四川牡丹和圓裂四川牡丹各自的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。

引起物種遺傳分化的原因有很多，如繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、居群間遺傳隔離等[40]。一般來說，自交植物的遺傳變異大都存在居群間，異交植物的遺傳變異大部分存在居群內(nèi)[41]。Nybom和Bartish得出自交、混合交配、異交植物的平均Gst分別是0.59、0.19、0.23[42]，據(jù)此推測四川牡丹和圓裂四川牡丹的繁育系統(tǒng)屬于異交型，與駱勁濤[36]關于四川牡丹傳粉生物學研究一致，并且可能是居群間遺傳分化較小的主要原因。如果居群小且居群間存在隔離，遺傳漂變就會影響遺傳結構并加強居群間遺傳分化[43-44]。據(jù)野外實地調查且文獻記錄四川牡丹和圓裂四川牡丹居群內(nèi)個體數(shù)量都極為有限[38]，很容易引起遺傳漂變，加劇遺傳分化的發(fā)生。根據(jù)Mantel檢測結果顯示四川牡丹居群間遺傳距離和地理距離呈正相關(r=0.776，P=0.01)，表明地理隔離對四川牡丹居群遺傳分化有一定影響。這可能是由于四川西北特殊的地形如地形復雜、山脈多、海拔高，導致了居群間存在一定的隔離而引起居群間產(chǎn)生分化?；蛄鲗ΨN群的遺傳分化也有很重要的影響。居群遺傳學理論認為，當基因流小于1時，就不足以抵抗居群內(nèi)因遺傳漂變導致的遺傳分化[45]，即居群間基因流受到限制時，短距離的居群就會出現(xiàn)遺傳分化[46]。本研究表明四川牡丹與圓裂四川牡丹種下居群間的基因流分別是0.906 5和0.819 0，都小于1，表明居群間的基因交流有限，從而導致居群出現(xiàn)遺傳分化。

聚類分析結果顯示四川牡丹和圓裂四川牡丹種間出現(xiàn)了明顯的分化，聚為兩大支，可能是長時間的地理隔離導致的，支持兩者是獨立的物種。由于居群數(shù)少且居群內(nèi)個體少，采集到的樣本較少，因此在統(tǒng)計分析中可能存在一些偏差。

3.3 保護策略

經(jīng)過野外實地調查，發(fā)現(xiàn)四川牡丹的自然生長環(huán)境已經(jīng)遭受嚴重破壞，居群個體數(shù)量少，圓裂四川牡丹受到的破壞也較嚴重，例如，丹巴居群遭受滑坡影響，居群內(nèi)個體零星分布；馬爾康居群受到人為的砍伐；黑水居群遭受修公路破壞；松潘居群受放牧影響，種子大部分被動物啃食，實生苗較少；理縣大溝口村居群的破壞更嚴重，據(jù)當?shù)卮迕窠榻B，曾有很多圓裂四川牡丹分布，由于修電站，居群個體大面積被淹沒。除了自身特性外，推測人為干擾和自然災害也是其瀕危的重要原因，四川牡丹和圓裂四川牡丹分布本就狹窄，居群又少，加上各種程度的人為和自然的破壞，導致瀕危程度加劇。它們可能是重要的野生牡丹種質資源，急需制定保護策略保護自然居群，進而保持現(xiàn)有的物種多樣性，防止居群退化甚至滅絕[47]。

根據(jù)遺傳結構及野外考察，建議采取以下保護措施：(1)保護現(xiàn)有居群及生境是保護珍稀瀕危植物的最好最有效的措施，減少對四川牡丹和圓裂四川牡丹生態(tài)環(huán)境的破壞，嚴禁非法采挖，建立保護區(qū)和種質資源庫。四川牡丹種子萌發(fā)率不是很低，但四川牡丹和圓裂四川牡丹生長在灌木叢中，受到群落內(nèi)其他優(yōu)勢種的競爭排斥，在減少破壞的情況下，適當降低其他植物的郁閉度。(2)通過對遺傳結構的分析，物種水平上仍保留較高的遺傳多樣性，居群水平上四川牡丹遺傳多樣性最高的是金川曾達鄉(xiāng)居群，最低的是馬爾康居群，圓裂四川牡丹遺傳多樣性最高的是黑水居群，最低的是理縣居群，相關部門應對這些居群予以重視，建立保護區(qū)或保護點，如若加以重視和保護，四川牡丹及圓裂四川牡丹種群仍有恢復的潛能。(3)四川牡丹和圓裂四川牡丹的遺傳變異主要存在居群內(nèi)，在遷地保護時，應最大限度采樣，防止遺傳多樣性的丟失。

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(編輯:宋亞珍)

Genetic Diversity of Paeonia decomposita and Paeonia decomposita subsp. rotundiloba Detected by ISSR Markers

TONG Fen, XIE Dengfeng, ZENG Xinmei, HE Xingjin*

(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

The genetic diversity of 5 populations ofPaeoniadecompositaand 4 populations ofPaeoniadecompositasubsp.rotundilobawas dectected by inter-simple sequence repeat markers(ISSR). (1) ForP.decomposita, the percentage of polymorphic loci(PPB) at the species level, Nei’s gene diversity(H) and Shannon’s information index(I) were 89.36%, 0.291 4, 0.441 3, respectively, while forP.decompositasubsp.rotundiloba, the three indices were 81.91%, 0.285 7, 0.428 5, respectively, all lower than that ofP.decomposita’s. The genetic variation of them were little lower at population level. (2) The coefficient of genetic differentiation among population(Gst) was 0.355 5 forP.decompositaand 0.379 1 forP.decompositasubsp.rotundiloba, suggesting that for both species there is a high genetic differention within population; the gene flow of the two species was 0.906 5 and 0.819 0, respectively and show that gene flow was limited among populations. (3) Mantel test indicated that there was a significant correlation between genetic and geographic distances amongP.decompositapopulations, whereas no significant correlation between genetic and geographic distances ofP.decompositasubsp.rotundilobapopulations. (4) UPGMA analysis showed significant genetic differention between the two species at molecular level, supporting the view that they are two separate species. The study indicated thatP.decompositasuffered human disturbance and natural disaster may be its endangered reasons.P.decompositasubsp.rotundilobapopulations are subjected to severe disruption as well, even more serious thanP.decompositapopulations. So all the individuals of populations should be protectedinsitutimely, and it is as large as possible to gain the sample in order to reserve their genetic diversity owning to the genetic variation mainly exist in population.

Paeoniadecomposita;Paeoniadecompositasubsp.rotundiloba; genetic diversity; ISSR

1000-4025(2016)10-1968-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1968

2016-07-07;修改稿收到日期:2016-10-13

國家自然科學基金(31470009，31270241，31570198)；國家標本平臺教學標本子平臺(http：//mnh.scu.edu.cn/)

童 芬(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事生物安全、保護生物學研究。E-mail：tongfen191004@163.com

*通信作者:何興金，教授，博士生導師，主要從事植物系統(tǒng)和分子進化，保護生物學方面的研究。E-mail：xjhe@scu.edu.cn

Q346．+5；Q789

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