楊青青，劉希望，楊亞軍，李劍勇，查 飛

(1.西北師范大學化學化工學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

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兩種定值方法測定阿司匹林丁香酚酯對照品的含量

楊青青，劉希望，楊亞軍，李劍勇，查 飛

(1.西北師范大學化學化工學院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

目的：采用質量平衡法與核磁共振法，測定阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester，AEE)對照品含量。方法：采用高相液相色譜測定純度，采用干燥失質量法測定水分和揮發(fā)性物質，熾灼殘渣測定無機鹽雜質，根據質量平衡法計算AEE對照品含量。建立核磁共振定量測定AEE含量的方法，儀器溫度25 ℃，掃描次數(NS)16次，弛豫延遲時間(Dl)15 s。結果：質量平衡法測定的AEE對照品含量為99.82%；核磁共振定值結果為99.55%，AEE和內標物(1,4-二硝基苯)峰面積的比值與質量比在3～21 mg范圍內呈良好線性關系(R2=0.999)，日內精密度的RSD值為0.04%(n=5)，重復性的RSD值為0.19%(n=5)，穩(wěn)定性測定的RSD值為0.57%。結論：2種方法相互驗證，測定結果基本一致。

質量平衡法； 核磁共振法； 對照品； 阿司匹林丁香酚酯； 方法驗證

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester，AEE)，是由阿司匹林與丁香酚酯化反應制得的具有解熱、鎮(zhèn)痛、降血脂、抗血栓作用的新型化合物[1-2]。根據臨床試驗和相關文獻記載，阿司匹林治療范圍極廣，包括上呼吸道感染、發(fā)熱、頭痛、關節(jié)痛、風濕痛等，還能預防術后血栓形成、心肌梗死和中風。一般阿司匹林劑量較少時，不會引起不良反應，但長期大量用藥會出現惡心、嘔吐、胃腸道出血等不良反應[3-5]。丁香酚具有解熱、抑菌、抗氧化、抗腫瘤作用，但也存在腐蝕性、刺激性和毒性等副作用[6-7]。AEE在不改變阿司匹林和丁香酚單獨發(fā)揮臨床作用的結構部位的基礎上，較前2種藥物具備以下優(yōu)勢：低毒性、降低了丁香酚的刺激性和易氧化性，同時也降低了阿司匹林對胃腸道直接的酸刺激[8]。該藥是自主研發(fā)的新型化學合成藥物，目前處于臨床研究階段，故開展AEE標準物質含量測定方法的研究可以為原料藥及相關制劑質量標準的制定奠定基礎。核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波譜分析被廣泛用于化學、食品、農業(yè)及醫(yī)藥等現代科學研究領域，主要用于有機化合物結構的確定和化學動力學的研究，在其他領域的應用也在擴大。除了定性測定外，NMR的定量測定方法也被各國藥典收錄。定量測定時需選擇合適的定量峰，確定積分面積即可計算物質含量。本研究通過質量平衡法與NMR定量方法測定了AEE對照品的含量，報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜(配2998二極管陣列檢測器，Waters Corporation)；Varian 400型NMR儀(美國瓦里安公司)；BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DZF-6030A型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；馬弗爐(北京盈安美誠科學儀器有限公司)

1.2 藥品與試劑

氘代氯仿(純度99.8%，含0.03%四甲基硅烷，Sigma)、甲醇及乙腈(色譜純，Fisher)；1,4-二硝基苯(純度99.4%，Sigma)、AEE對照品(由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所制)。AEE的結構式見圖1。

圖1 AEE的結構式Fig 1 Structure of AEE

2 方法

2.1 質量平衡法測定AEE對照品的含量

質量平衡法計算公式：含量(%)=色譜純度×(1-干燥失重-熾灼殘渣)×100%[9]。

2.1.1 純度測定：(1)液相色譜。①條件1。色譜柱Hypersil ODS C18(100 mm×4.6 nm，3 μm)；流動相甲醇-水(V∶V=80∶20)；流速1 ml/min；檢測波長279 nm；進樣量10 μl。②條件2：色譜柱Hypersil BDS C18(150 mm×4.6 nm，5 μm)；流動相乙腈-水(V∶V=85∶15)；流速1 ml/min；檢測波長279 nm；進樣量10 μl。(2)配制AEE供試品溶液：準確稱量AEE對照品3份，每份10.0 mg，加甲醇配制為1 mg/ml的溶液，精密量取1 ml置于10 ml容量瓶，稀釋至刻度得A溶液。準確稱量AEE對照品3份，每份10 mg，加乙腈配制為1 mg/ml的溶液，精密量取1 ml置于10 ml容量瓶，稀釋至刻度得B溶液。(3)測定方法：采用色譜條件①、②分別測定對照品的純度。

2.1.2 揮發(fā)性物質：水分與殘留溶劑都是揮發(fā)性物質，參照《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)[10]0831干燥失質量測定方法，將研磨的粉末AEE于(25±2)℃、800 Pa的真空干燥箱，無水氯化鈣為干燥劑，計算干燥失質量。

2.1.3 熾灼殘渣：參照《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)[10]0841熾灼殘渣檢查法，將試樣灼燒至完全碳化，再加H2SO40.5～1.0 ml并熾灼(700～800 ℃)至恒質量后，稱量計算遺留的金屬氧化物或其硫酸鹽。

2.2 NMR法測定AEE對照品含量

按NMR條件平行測定供試品溶液5份，采集圖譜，處理圖譜，對定量峰積分，按照核磁定量方法計算AEE含量[11-13]。計算公式為：ms=ms×(As/Ar)×(Es/Er)[14]，其中，E=樣品分子量/產生該共振峰的基團中的質子數；Er為內標物在該化學位移處的質子當量。經公式化簡推倒得：Ws(%)=[(As/ns)×Ms×mr] / [(Ar/nr)×Mr×ms]×Wr，其中，As為被測樣品定量峰的積分面積，ns為被測樣品定量峰包含的質子數，Ms為被測樣品的相對分子質量，Ar為內標物質定量峰的積分面積，nr為內標物質定量峰包含的質子數，Mr為內標物質的相對分子質量，mr為稱取的內標質量，Wr為內標的質量百分含量，ms為樣品質量。

2.2.1 儀器參數：溫度25 ℃，掃描次數(NS)16次，弛豫延遲時間(D1)15 s，其他條件為儀器內設條件。

2.2.2 供試品溶液配制：分別精密稱量AEE與1,4-二硝基苯15.0、9.0 mg，加入氘代氯仿0.6 ml溶解，振蕩搖勻，轉移至核磁管待測。

2.2.3 含量測定：將配置好的供試品溶液分別進行測定，采集圖譜，經傅里葉變換、相位校正和基線校正，歸屬確認為AEE的結構[13]，對內標和對照品的定量峰積分，取多次積分的平均值減少積分誤差，根據NMR定量方法計算AEE對照品含量。

2.2.4 線性范圍：分別準確稱量AEE 3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0、21.0 mg，置于7支核磁管，并加入標準物對硝基苯9.0 mg，加入0.6 ml的氘代氯仿溶解，測定1H-NMR譜，并對樣品與內標物的定量峰積峰。以AEE與對硝基苯的質量比為橫坐標，以AEE和對硝基苯的積峰面積比為縱坐標，作線性回歸。

2.2.5 精密度試驗：將同一樣品溶液連續(xù)測定5次，以AEE的不同定量峰(δ=3.901、2.294)與內標物的定量峰(δ=8.412)積分面積的比值計算RSD值。

2.2.6 重復性試驗：平行制備測試溶液5份，測定1H-NMR，按方法中的公式計算AEE的含量，并計算RSD值。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗：設內標物定量峰峰面積為100，在1、2、3、4、5 d分別測定樣1H-NMR譜，計算樣品峰的峰面積的RSD值。

3 結果

通過液相色譜測定AEE對照品的純度，測定結果除了主峰以外，無其他雜質峰，按峰面積歸一化法處理，純度為100%，見圖2。據干燥失質量法測定水分與揮發(fā)性物質的質量百分比為0.13%(n=8)。熾灼殘渣法測定金屬氧化物或其硫酸鹽含量為0.0475%(n=8)。分別代入公式計算AEE對照品含量=100%×(1-0.13-0.0475)×100%=99.82%。NMR法以AEE的定量峰(δ=2.294)與內標物的定量峰(δ=8.412)的積分面積代入實驗數據，并求5次計算的平均值，計算結果為99.55%。線性回歸方程Y=0.003 47+0.426 58X，回歸系數R2=0.999，表明其在3～21 mg范圍內線性關系良好。精密度試驗結果顯示，以AEE的不同定量峰(δ=3.901、2.294)與內標物的定量峰(δ=8.412)積分面積的比值計算RSD值均為0.04%，表示該方法精密度良好。平行測定5份樣品分別計算AEE的含量，其RSD值為0.19%，表示該方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗結果顯示，在1、2、3、4、5 d測定樣品，樣品峰的峰面積RSD值為0.57%，說明AEE在5 d內穩(wěn)定性良好。

1.內標物苯環(huán)氫；2.AEE甲氧基氫(—OCH3)；3.AEE乙酰氧基氫(—OAc)1.Inner standard hydrogen of benzene；2.Methyoxy hydrogen of AEE(-OCH3)；3.Acetoxyl hydrogen of AEE(-OAc)圖2 AEE與內標物的氫譜圖Fig 2 1H-NMR spectra of AEE and internal standards

4 討論

質量平衡法是常用的進行含量測定的方法之一，具有簡單方便、結果可靠的優(yōu)點。NMR法主要在于內標物的選擇、溶劑與定量峰的選擇、儀器參數的選擇。(1)NMR定量分析常用的內標物有：1,4-二硝基苯、對苯二甲酸二甲酯、馬來酸、富馬酸等。綜合考慮，1,4-二硝基苯作為內標物，苯環(huán)上的4個氫為單峰，其化學位移δ=8.41，能與樣品峰很好地分離，且不與樣品發(fā)生反應，故選擇1,4-二硝基苯為內標物。(2)常用的氘代試劑有重水、二甲基亞砜、氘代氯仿、氘代甲醇等。實驗過程選擇氘代氯仿作為溶劑，該試劑對樣品和內標物都有很好的溶解性，且氘代氯仿的溶劑峰化學位移δ=7.26，不干擾內標和樣品的定量峰，不影響實驗結果。(3)AEE的氫譜歸屬δ為7.15～8.24(4H，m，C6H4)、6.79～7.05(3H，m，C6H3)、5.92～6.02(1H，m，—CH=)、5.09～5.15(2H，m，=CH2)、3.80(3H，s，OCH3)、3.39(2H，d，—CH2—)、2.29(3H，s，OAc)。定量峰優(yōu)先選擇含有多個氫的單峰，故選擇δ=3.80(OCH3)與δ=2.29(OAc)作為定量峰，兩者測定結果基本相同，故選擇δ=2.29的峰作為定量峰。(4)設定準確的弛豫時間Dl，確保所有的信號被檢測到，保證積分的正確性，對實驗測定結果的準確性有重大意義。據文獻報道，Dl應>5倍的縱向弛豫時間(T1)。使用不同Dl值試驗其對積分面積大小的影響，結果選擇D1=15 s。(5)對NMR法定量測定AEE含量的方法進行了方法學研究，考察了方法的線性范圍、精密度、重復性及穩(wěn)定性。結果顯示，該方法簡便易行、精密度高|重復性好。

綜上所述，本研究通過質量平衡法和NMR法等2種不同定值方法對AEE對照品的含量進行了測定。實驗結果證明，質量平衡法和NMR法測定結果基本一致，兩者互相佐證能更好地確定AEE對照品含量的準確性。本研究中AEE含量的確定為今后制定其原料藥及制劑的質量標準提供了基礎，也為其他新物質對照品的定值提供了相關依據。

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Content Determination of Aspirin Eugenol Ester Reference Substance by Two Measuring MethodsΔ

YANG Qingqing1, LIU Xiwang2, YANG Yajun2, LI Jianyong2, ZHA Fei1

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Northwest Normal University,Gansu Lanzhou 730070, China; 2.Key Laboratory of New Animal Drug Project, Gansu Province; Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development, Ministry of Agriculture; Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS,Gansu Lanzhou 730050, China)

OBJECTIVE：To determine the content of aspirin eugenol ester(AEE) reference substance by by the mass balance method and the nuclear magnetic resonance(NMR) method. METHODS: Chromatogram purity was determined by HPLC, the moisture and volatile substance were determined by weightlessness method and inorganic impurities was determined by the residue on ignition method. The content of AEE reference substance was calculated by the mass balance method. NMR quantification method for AEE was established with determine temperature of 25 ℃, scan times of 16 and the relaxation delay time of 15 s respectively. RESULTS: The results of content determination were 99.82% by the mass balance method and 99.55% by the NMR method.Fitting line between peak area ratio and weight ratio of sample AEE to inner standard(1,4-dinitrobenzene) ranged from 3 mg to 21 mg with correlative coefficient of 0.999. Method validation of the NMR about the precisionRSDwas 0.04%(n=5)and the repeatabilityRSDwas 0.19%(n=5)and the stability ofRSDwas 0.57%. CONCLUSIONS: Two methods can verify each other and the determination results are basically identical.

Mass balance method; NMR method; Reference substance; Aspirin eugenol ester; Aspirin

中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(No.CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-02)

R927.2

A

1672-2124(2016)11-1466-03

2016-08-22)

*碩士研究生。研究方向：現代分離分析技術。E-mail：1327571141@qq.com

#通信作者1：研究員，博士。研究方向：獸藥的研究與開發(fā)。E-mail：lijy1971@163.com

#通信作者2：教授，博士。研究方向：環(huán)境與能源化工、現代分離分析技術。E-mail：zhafei@nwnu.edu.cn

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.11.007