孔令提，劉 冬，宋春麗，朱裕林

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004； 2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 408400)

?

采用Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型研究胺碘酮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及阿托伐他汀對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

孔令提，劉 冬，宋春麗，朱裕林

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004； 2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 408400)

目的：探討胺碘酮的腸吸收特性，評(píng)價(jià)聯(lián)合應(yīng)用阿托伐他汀是否影響胺碘酮的腸吸收。方法：采用Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型，研究胺碘酮在不同濃度下從絨毛面(apical，AP)側(cè)到基底面(basolateral，BL)側(cè)，以及從BL側(cè)到AP側(cè)2個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，計(jì)算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient，Papp)，考察其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，同時(shí)考察維拉帕米、阿托伐他汀對(duì)其Papp值的影響。結(jié)果：不同濃度(10、20、40 μmol/L)胺碘酮的雙側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)量均隨濃度增高而相應(yīng)增大；不同濃度胺碘酮雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Papp值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且外排比率均<1.5；加入維拉帕米或阿托伐他汀對(duì)胺碘酮的Papp值無(wú)顯著影響(P>0.05)；表明胺碘酮的腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。結(jié)論：胺碘酮的腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，聯(lián)合應(yīng)用阿托伐他汀時(shí)不會(huì)影響胺碘酮的腸吸收。

胺碘酮； 阿托伐他汀； Caco-2細(xì)胞模型； 表觀滲透系數(shù)

胺碘酮是一種以Ⅲ類藥理作用為主的心臟離子多通道阻滯劑，臨床適用于房性、室性、結(jié)性及伴預(yù)激綜合征(W-P-W綜合征)的心律失常，是目前最常用的抗心律失常藥之一[1]。阿托伐他汀除具有調(diào)節(jié)血脂作用外，還具有抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、改善血管內(nèi)皮功能等作用，臨床常與胺碘酮聯(lián)合應(yīng)用[2-5]，但兩者之間是否存在相互作用尚不明確。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是小腸上皮細(xì)胞上一種主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將細(xì)胞內(nèi)藥物(底物)逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，從而影響口服藥物的生物利用度[6]。Caco-2細(xì)胞可通過(guò)上皮樣分化而形成緊密連接，其在形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)及滲透性等方面具有與小腸上皮細(xì)胞相同的特性，具有P-gp高表達(dá)特性，與藥物的體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性，目前被廣泛用于新藥篩選及藥物吸收性相互作用的研究[7-9]。本研究采用Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型探討胺碘酮的腸吸收特性，同時(shí)研究阿托伐他汀對(duì)胺碘酮在小腸吸收的影響，以評(píng)價(jià)兩者是否存在吸收性藥物相互作用。

1 材料

1.1 儀器

EVOM細(xì)胞電位儀(美國(guó)Millipore公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

Caco-2細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù)，傳代數(shù)為30～40代)；胎牛血清、非必需氨基酸、雙抗(美國(guó)Gibco公司)；DMEM液體培養(yǎng)基、漢克平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(北京索萊寶公司)；6孔Transwell培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、噻唑蘭(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、鼠尾膠原蛋白(美國(guó)Sigma公司)；鹽酸胺碘酮標(biāo)準(zhǔn)品、黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供)；乙腈、三乙胺均為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

將Caco-2細(xì)胞株從液氮中取出，置于37 ℃水浴中不斷振搖，待化凍完畢后移至超 凈臺(tái)，取出細(xì)胞懸液，加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(下同)，離心(轉(zhuǎn)速1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入5 ml DMEM培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱(下同)中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合約80%時(shí)，移除培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2次，加入胰蛋白酶消化，置于培養(yǎng)箱中，5 min后取出，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，用滅菌吸管吹打成細(xì)胞懸液，離心(轉(zhuǎn)速1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入含有DMEM培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml，加入96孔板，每孔接種100 μl，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后分別加入系列濃度的胺碘酮溶液100 μl(DMSO終濃度為1%)，并將含1% DMSO的HBSS溶液作為陰性對(duì)照，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，吸出上清液，加入空白HBSS 100 μl及MTT(5 mg/ml)20 μl，再培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入DMSO 100 μl，待甲瓚完全溶解后，采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度，從而計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml，以3×105個(gè)/孔的密度接種于包被鼠尾膠原的六孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板絨毛面(apical，AP)側(cè)，基底面(basolateral，BL)側(cè)加入培養(yǎng)液2.6 ml，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞分化形成致密的單細(xì)胞層后，用電阻儀測(cè)定跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，取TEER>400 Ω/cm2的孔進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.5 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下電阻符合要求的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板，于AP側(cè)加入37 ℃預(yù)熱的pH為7.4的HBSS(下同)1.5 ml，BL側(cè)加入HBSS 2.6 ml，于培養(yǎng)箱中孵育20 min，棄去雙側(cè)HBSS，重復(fù)3次。在AP或BL側(cè)加入用HBSS配制的胺碘酮溶液(10、20和40 μmol/L)1.5或2.6 ml，BL或AP側(cè)加入含1% DMSO的HBSS 2.6或1.5 ml，于培養(yǎng)箱中孵育，分別于20、40、60、80、100、120 min從BL或AP側(cè)收集透過(guò)液樣品200 μl，并補(bǔ)充同體積接收液，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)孔。為考察P-gp抑制劑維拉帕米或阿托伐他汀對(duì)胺碘酮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，分別在AP或BL側(cè)加入含100 μmol/L維拉帕米或50 μmol/L阿托伐他汀的胺碘酮溶液(20 μmol/L)1.5或2.6 ml，余同。

2.6 含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱Hypersil BDS C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相2%三乙胺(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.8)-乙腈(V∶V=40∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；流速0.8 ml/min[10-11]。精密吸取200 μl樣品溶液，加入內(nèi)標(biāo)20 μl(黃體酮，20.0 μg/ml)，混勻后以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液20 μl進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中胺碘酮的濃度。

2.7 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加入不同濃度胺碘酮后，經(jīng)過(guò)3 h孵育，細(xì)胞的存活率見(jiàn)圖1，可見(jiàn)胺碘酮濃度<200 μmol/L時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率達(dá)80%以上，后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)胺碘酮藥物濃度分別選取10、20和40 μmol/L。

圖1 不同濃度胺碘酮對(duì)Caco-2細(xì)胞生存率的影響Fig 1 Effects of different concentration of amiodarone on cell survival rate of Caco-2

3.2 胺碘酮轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

胺碘酮在不同濃度下從AP→BL及BL→AP的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨濃度的增高而相應(yīng)增大，見(jiàn)圖2—3。不同濃度胺碘酮的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Papp值見(jiàn)表1，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，不同濃度之間Papp值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且ER均<1.5。

圖2 不同濃度胺碘酮從AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量Fig 2 Transport amount of different concentration of amiodarone from AP→BL

圖3 不同濃度胺碘酮從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量Fig 3 Transport amount of different concentration of amiodarone from BL→AP

組別Papp(×106)( x±s)AP→BLBL→APER10μmol/L胺碘酮7 03±0 536 62±0 430 9420μmol/L胺碘酮6 36±0 316 46±0 101 0240μmol/L胺碘酮7 24±0 336 50±0 100 9020μmol/L胺碘酮+維拉帕米7 06±1 086 57±0 330 9320μmol/L胺碘酮+阿托伐他汀6 85±0 486 84±0 741 00

3.3 維拉帕米和阿托伐他汀對(duì)胺碘酮轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

在存在維拉帕米或阿托伐他汀條件下，胺碘酮的Papp值見(jiàn)表1，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，加入維拉帕米或阿托伐他汀后，胺碘酮的Papp值與不存在維拉帕米或阿托伐他汀時(shí)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明維拉帕米或阿托伐他汀不影響胺碘酮的轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 討論

采用Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制時(shí)，可根據(jù)藥物的ER判斷藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)類型，若ER>1.5，提示可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制；若ER<1.5，則表明以被動(dòng)擴(kuò)散為主。此外，如不同濃度下測(cè)得的Papp值基本保持恒定，則可間接說(shuō)明其轉(zhuǎn)運(yùn)不需要載體的介入，同樣表明轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以被動(dòng)擴(kuò)散為主[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)中，胺碘酮不同濃度之間Papp值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組的ER均<1.5，且P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)其Papp值無(wú)顯著影響，表明胺碘酮在小腸上皮細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。阿托伐他汀與胺碘酮合用時(shí)，胺碘酮的Papp值與單用胺碘酮時(shí)的Papp值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明阿托伐他汀不影響胺碘酮的吸收。

綜上所述，胺碘酮在Caco-2單層細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散形式進(jìn)行，臨床聯(lián)合應(yīng)用胺碘酮與阿托伐他汀時(shí)無(wú)需考慮腸吸收方面的相互作用。

[1]中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)心律分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)，胺碘酮抗心律失常治療應(yīng)用指南工作組.胺碘酮抗心律失常治療應(yīng)用指南：2008[J].中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志，2008，22(5)：377-385.

[2]許賢利，季明，饒大勇，等.胺碘酮與阿托伐他汀聯(lián)合治療陣發(fā)性心房顫動(dòng)的療效分析[J].中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2013，5(5)：519-520.

[3]李滿生，王會(huì)霞，石建克，等.阿托伐他汀鈣在胺碘酮轉(zhuǎn)復(fù)持續(xù)性心房顫動(dòng)中的作用觀察[J].中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志，2011，25(5)：411-413.

[4]胡國(guó)智，羅萍.胺碘酮聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)防冠狀動(dòng)脈搭橋圍術(shù)期房顫的臨床觀察[J].中國(guó)藥房，2015，26(15)：2057-2059.

[5]杜海燕，方振威，林陽(yáng).他汀類藥物防治動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病相關(guān)指南解讀及其臨床應(yīng)用現(xiàn)狀分析[J].中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2015，15(2)：148-153.

[6]任夏洋，趙志剛.藥物吸收性相互作用的案例分析[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(14)：1107-1109.

[7]Krishna G，Chen K，Lin C，et al.Permeability of lipophilic compounds in drug discovery using in-vitro human absorption model，Caco-2[J].Int J Pharm，2001，222(1)：77-89.

[8]楊海濤，王廣基.Caco-2單層細(xì)胞模型及其在藥學(xué)中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35(10)：797-800.

[9]高坤，孫進(jìn)，何仲貴.Caco-2細(xì)胞模型在口服藥物吸收研究中的應(yīng)用[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(6)：73-78.

[10] 朱嘉俊，呂燕平，郁穎佳，等.HPLC法測(cè)定鹽酸胺碘酮及其有關(guān)物質(zhì)的含量[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2014，23(5)：296-300.

[11] 沈雄榮，宋向明，葉勇，等.HPLC法測(cè)定人血漿中胺碘酮及其代謝產(chǎn)物去乙基胺碘酮的濃度[J].中國(guó)藥房，2016，27(14)：1919-1921.

[12] Li N，Wang D，Ge G，et al.Ginsenoside metabolites inhibit P-glycoprotein in vitro and in situ using three absorption models[J].Planta Med，2014，80(4)：290-296.

[13] 陳江華，楊林，鄧中平.山豆根中主要成分在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)特性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(13)：5-8.

[14] Chen Y，Liu X，Pan R，et al.Intestinal transport of 3,6′-disinap-oylsucrose, a major active component of Polygala tenuifolia, using Caco-2 cell monolayer and in situ rat intestinal perfusion models[J].Planta Medica，2013，79(15)：1434-1439.

[15] 席駿鉆，錢大瑋，段金廒，等.β-環(huán)糊精包合物對(duì)香附四物湯揮發(fā)油中主要成分在Caco-2細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(15)：2970-2974.

Study on Transport Mechanism of Amiodarone and Effect of Atorvastatin on Transport of Amiodarone by Caco-2 Cell Monolayer ModelΔ

KONG Lingti1, LIU Dong2, SONG Chunli1, ZHU Yulin1

(1.Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Bengbu 233004, China; 2.Dept.of Pharmacy, Chongqing Nanchuan District People’s Hospital, Chongqing 408400, China)

OBJECTIVE：To probe into the intestinal absorption characteristics of amiodarone, and to evaluate the effects of combination of atorvastatin on intestinal absorption of amiodarone. METHODS: The apparent permeability coefficients(Papp) of amiodarone in both the apical-to-basolateral(AP→BL) and the basolateral-to-apical(BL→AP) direction were studied by using the Caco-2 cell monolayer model, the transport mechanism of membrane-disrupting were also evaluated. And the effects of verapamil and atorvastatin on the Papp value was determined. RESULTS: The bilateral transfer capacity of amiodarone increased with the ascent of concentration(10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L). There was no significant difference in Papp values of different concentrations(P>0.05), and the outside ratio were all less than 1.5. There was no obvious effects on Papp values with verapamil or atorvastatin(P>0.05), which indicated that the transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone was passive diffusion. CONCLUSIONS: The passive diffusion is the main transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone, and combination of atorvastatin does not affect the intestinal absorption of amiodarone.

Amiodarone; Atorvastatin; Caco-2 cell monolayer; Apparent permeability coefficient

蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.BYKY1425ZD)

R96

A

1672-2124(2016)11-1472-03

2016-07-26)

*主管藥師，博士。研究方向：臨床藥理學(xué)及臨床藥學(xué)。E-mail：konglingti@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.11.009