施瑩，林玲，闞佳音，劉海燕，馬增偉，李雙宇

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院微形態(tài)實驗中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

MiR200對腎癌細(xì)胞增殖的影響分析

施瑩1，林玲1，闞佳音1，劉海燕2，馬增偉1，李雙宇1

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院微形態(tài)實驗中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

目的 研究MiR200對腎癌細(xì)胞增殖的影響。 方法 整群選取2013年1月—2015年1月于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院就診的51例腎癌患者病理細(xì)胞和正常癌旁組織細(xì)胞，以及構(gòu)建裸鼠腎癌模型，測量MiR-200在不同細(xì)胞中的表達(dá)量和腫瘤增殖情況。 結(jié)果MiR-200在裸鼠的SN12-PM6和人的786-o、A498表達(dá)中均低于正常組織的表達(dá)（P＜0.05），在48 h后能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖（P＜0.05），48～72 h抑制情況最為顯著（P＜0.05）。 結(jié)論 MiR-200在腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)水平，能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖并能夠抑制裸鼠腎癌細(xì)胞生長。

MiR200；腎癌細(xì)胞；增殖

臨床上發(fā)現(xiàn)腎癌的患病例數(shù)逐年增加，而通常腎癌晚期已經(jīng)失去了最佳手術(shù)機會，放療和化療成為了治療腎癌的主要手段[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，MiRNAs在腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，可能會影響腫瘤細(xì)胞增殖，該研究以2013年1月—2015年1月于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院就診的51例腎癌患者和BALB/C裸鼠為研究對象，旨在研究MiR200對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者知情同意。整群選取2013年1月—2015年1月該齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎癌住院患者51人病理資料，其中男28人，女23人，年齡43～78歲，平均（62.63±4.89）歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為腎癌[4]，未合并糖尿病等其他臟器功能障礙。實驗用20只BALB/C裸鼠購自北京市疾病預(yù)防控制中心，4～5周，16～18 g，隨機分為兩組，每組各10只，分別為MiR-Ctr組和MiR-200組，均按照SOF級環(huán)境飼養(yǎng)并按照動物建模手術(shù)操作原則進(jìn)行操作。鼠源腎癌細(xì)胞株SN12-PM6，人源腎癌細(xì)胞株A498和786-o購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。用MTT法檢測MiR-200對腎癌細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2 裸鼠建模及腎癌腫瘤細(xì)胞生長檢測

裸鼠腎SN12-PM6細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化離心PBS重懸，冰上保存。裸鼠腹腔注射1%水合氯醛溶液麻醉，將已備好的細(xì)胞懸液20 μL植于鼠左側(cè)腎臟實質(zhì)內(nèi)，縫合皮膚，置于SPF下飼養(yǎng)。隔日觀察裸鼠體重，第5周時用影像學(xué)方法檢測腫瘤細(xì)胞生長情況。第6周末處死裸鼠，解剖取其雙腎，稱量雙腎后用4%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟、切片并進(jìn)行HE染色及免疫組化反應(yīng)

1.3 MiR200的表達(dá)量檢測

選取融合度達(dá)到90%以上并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS沖洗后，Trizol法提取總RNA.提取的RNA經(jīng)RT master mix法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行定量PCR擴增以U6為參照，取癌旁組織平均值，使用2-△△Ct計算腎癌細(xì)胞中MiR-200的表達(dá)倍數(shù)。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，Trizol法提取總RNA.提取的RNA經(jīng)RT master mix法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行定量PCR擴增以U6為參照，取癌旁組織平均值，使用2-△△Ct計算腎癌細(xì)胞中MiR-200的表達(dá)倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)運用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行錄入、分析。計量資料采用（）表示，多組間比較采用方差分析檢驗，計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌細(xì)胞株中MiR-200的表達(dá)

以人正常組織平均值為對照，MiR-200在腎癌細(xì)胞中表達(dá)值顯著降低，各細(xì)胞培養(yǎng)組間與對照組均有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 兩組細(xì)胞侵襲能力比較()

表1 兩組細(xì)胞侵襲能力比較()

細(xì)胞株平均表達(dá)量F P Normal（n=51）SN12-PM6（n=20）786-o（n=51）A498（n=51）1.014±0.005 0.027±0.003 0.041±0.011 0.062±0.009 14.872 ＜0.001

2.2 MiR-200對腎癌細(xì)胞增殖影響

使用MTT法于24、48、72、96 h和120 h檢測腎癌細(xì)胞抑制率情況，SN12-PM6與786-o均對腎癌細(xì)胞有抑制作用，24 h內(nèi)變化不顯著，48～72 h，MiR-200增長明顯放緩，超過72 h，抑制達(dá)到平臺期。見表2。

2.3 MiR-200抑制裸鼠腎臟腫瘤生長情況

兩組腫瘤形成率均為100%，形成率無差異，但MiR-200腫瘤重量明顯低于對照組，且免疫組化結(jié)果顯示，MiR-200的陽性率 （20%）也顯著低于對照組（80%）。見表3。

3 討論

隨著人類基因組計劃不斷進(jìn)展，超過 1500個MiRNA已被發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控超過30%的蛋白質(zhì)編碼基因，MiRNA不僅參與人體重要的正常生理活動，而且還參與疾病的發(fā)生與發(fā)展[5]。研究表明[7]，超過一半的MiRNA位于腫瘤發(fā)生的基因上，和腫瘤關(guān)系密切。目前已證實MiRNA與多種腫瘤相關(guān)，而腎癌相關(guān)研究卻報道很少，該研究證實MiR-200在腎癌細(xì)胞中表達(dá)量明顯低于癌旁組織，因此推斷MiR-200在腎癌的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移、侵襲中具有重要作用，通另根據(jù)不同時間截點測量人與裸鼠的抑制腎癌細(xì)胞增長發(fā)現(xiàn)，48～72 h，腎癌細(xì)胞抑制水平最為明顯，抑制率較高。而在裸鼠實驗中通過CDK2免疫組化染色比較，說明MiR-200能夠調(diào)節(jié)CDK2這個靶基因，從而抑制腎癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。研究表明[8]，每個MiRNA具有多個靶點，而一個靶點也同樣有多個MiRNAs對應(yīng)，如MiR-200可調(diào)節(jié)細(xì)胞上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化[9]，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]，該研究尚未針對具體位點和MiR-200作用降解靶基因的翻譯抑制機制以及不同階段阻斷細(xì)胞周期的研究，為下一步更系統(tǒng)深化的研究提出了新的方向與要求。

表2 MiR-200抑制腎癌增殖情況比較()

表2 MiR-200抑制腎癌增殖情況比較()

組別24 h 48 h 72 h 96 h 120 h SN12-PM6 miR-Ctr（n=20）miR-200（n=20）tP 786-o miR-Ctr（n=51）miR-200（n=51）tP 0.27±0.002 0.23±0.004 0.343 0.785 0.31±0.003 0.30±0.002 0.002 1.000 0.51±0.010 0.37±0.007 2.443 0.038 0.72±0.004 0.49±0.002 2.776 0.009 1.13±0.008 0.54±0.019 4.098＜0.001 1.97±0.006 1.01±0.009 5.473＜0.001 2.16±0.011 1.32±0.017 5.009＜0.001 2.53±0.006 1.55±0.004 5.558＜0.001 2.23±0.004 1.62±0.022 5.983＜0.001 2.65±0.012 2.02±0.010 4.972＜0.001

表3 兩組裸鼠腫瘤重量比較[(),mg]

表3 兩組裸鼠腫瘤重量比較[(),mg]

綜上所述，MiR-200在腎癌的增殖過程中具有重要意義，但是還需要具體明確MiRNA對下游靶基因的調(diào)控和反饋表達(dá)作用，也為腎癌如何抑制腫瘤提出了新的要求。

[1]王雪剛.MiR-200c抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2013.

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Analysis of the Effect of MiR200 on the Proliferation of Renal cell Carcinoma Cells

SHI Ying1,LIN Ling1,KAN Jia-yin1,LIU Hai-yan2,MA Zeng-wei1,LI Shuang-yu1
1.The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Department of Nephrology，Qiqihar，Heilongjiang Province, 161000 China;2.College of Pathology,Qiqihar Medical University,Micromorphological Experimental Center,Qiqihar，Heilongjiang Province,161000 China

Objective MiR200 proliferation of kidney cancer.Methods Group selection from January 2013-January 2015, 51 patients in the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University with renal cell carcinoma pathological cells and adjacent normal tissue cells,renal cancer and build nude model,measuring MiR-200 in different cells and the expression of tumor proliferation.Results MiR-200 in nude mice SN12-PM6 and human 786-o,A498 expression were lower than normal tissue expression(P＜0.05),at 48h after kidney can inhibit cancer cell proliferation(P＜0.05),48～72 h inhibition was most significant,(P＜0.05).Conclusion MiR-200 showed low levels of expression in tumor cells,can inhibit the proliferation of renal cell carcinoma and renal cancer cell growth in nude mice can be suppressed.

MiR200；Renal cell carcinoma；proliferation

R737.11

A

1674-0742（2016）06（b）－0023-02

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.17.023

2016-03-18）

齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計劃項目任務(wù)（FSGG201422）。

施瑩（1975.6-），女，本科，副主任醫(yī)師,研究方向：腎臟疾病。