劉兆軍，謝景興，侯震坤，魏寧，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

3種商品稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果的研究

劉兆軍，謝景興，侯震坤，魏寧，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

研究通過檢測精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體膜完整率來評(píng)價(jià)3種商品稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精液保存的效果。結(jié)果表明，日本某稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果要顯著優(yōu)于比利時(shí)以及英國某稀釋劑（P＜0.05），保存至第5天時(shí)日本某稀釋劑組的精子活率仍達(dá)到0.75，大于比利時(shí)某稀釋劑組的0.53和英國某稀釋劑組的0.51。此外，保存至第5天精子活率、頂體完整率、線粒體膜完整率保存效果上，比利時(shí)某稀釋劑組和英國某稀釋劑組較為相近，而在對(duì)質(zhì)膜完整率的保存效果上，英國某稀釋劑組要顯著優(yōu)于比利時(shí)某稀釋劑組（P＜0.05），保存至第5天時(shí)質(zhì)膜完整率英國某稀釋劑組和比利時(shí)某稀釋劑組分別為44.52%和32.48%。

關(guān)中黑豬；豬精液；商品稀釋劑；常溫保存

關(guān)中黑豬是陜西省家畜育種專家培育的肉脂兼用型品種，具有抗病力強(qiáng)、繁殖力高、耐粗飼等特點(diǎn)。由巴克夏豬、甘肅涇川八眉豬、四川內(nèi)江豬于20世紀(jì)70年代雜交繁育而成，并于20世紀(jì)80年代初完成鑒定獲得農(nóng)業(yè)部首批地理標(biāo)志產(chǎn)品品種。目前，關(guān)中黑豬養(yǎng)殖現(xiàn)狀處于保種狀態(tài)[1]。隨著人們消費(fèi)觀念的改變，關(guān)中黑豬肉將可能成為人們青睞的商品豬肉。人工授精技術(shù)是關(guān)中黑豬產(chǎn)業(yè)化的必然選擇，豬精液稀釋劑是進(jìn)行人工授精技術(shù)的關(guān)鍵之一，所以選擇適宜的精液稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬的人工授精技術(shù)推廣十分重要。目前，市場上銷售的商品稀釋粉種類繁多，且在地方品種或者培育品種精液常溫保存的研究報(bào)道不多。因此，選擇適宜關(guān)中黑豬精液的稀釋劑將有利于關(guān)中黑豬人工授精技術(shù)的推廣，并將促進(jìn)關(guān)中黑豬產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

本試驗(yàn)選取市售日本某稀釋劑、比利時(shí)某稀釋劑以及英國某稀釋劑，通過檢測精子活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線粒體膜完整性等指標(biāo)對(duì)比3種稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精液的常溫保存效果，比較不同商品稀釋劑的優(yōu)劣，為關(guān)中黑豬人工授精技術(shù)的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選取西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧教學(xué)試驗(yàn)基地的3頭10月齡關(guān)中黑豬種公豬作為精液來源動(dòng)物。3頭公豬性成熟且發(fā)育良好，均按照相同的常規(guī)飼養(yǎng)方式進(jìn)行單欄飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

pH試紙，市售日本某稀釋劑、比利時(shí)某稀釋劑以及英國某稀釋劑，雙蒸水，75%酒精，精子快速染液，Rh123（羅丹明123），PI（碘化丙啶），果糖-檸檬酸鈉低滲溶液。

Ibersan v11型精子密度儀、溫度計(jì)、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡，康佳BC-50MN 17℃恒溫冰箱、恒溫水浴鍋、37℃恒溫電熱板、移液槍、鑷子、滴管、玻璃棒等。

1.3 精液采集與處理

1.3.1 精液采集采用雙層手套手握法采精，用帶有4層過濾紗布和保溫杯收集富精子部分的精液。

1.3.2 檢測原精品質(zhì)手握法采集種公豬濃精部分并用4層醫(yī)用紗布過濾后，在保溫杯中保存，立即到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鏡檢，將精液用玻璃棒置于37℃恒溫載物臺(tái)上，觀察精子活力，稀釋后并計(jì)算其密度。選擇精子活率在0.70以上，色澤、氣味正常的精液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 精液稀釋、分裝及保存精液稀釋前2 h，將3種稀釋劑置于37℃的水浴鍋中升溫備用，將檢測合格的精液分成3組，Ⅰ組采用日本某稀釋劑、Ⅱ組采用比利時(shí)某稀釋劑、Ⅲ組采用英國某稀釋劑，均按照1∶2的比例緩慢將等溫稀釋劑沿容器壁緩慢加入精液中，輕輕搖晃混勻?；靹蚝髮⑾♂尯蟮呢i精液分裝到提前預(yù)熱到37℃的50 mL離心管中，然后用4層毛巾包裹緩慢降溫，室溫放置2 h后連同毛巾一起放入17℃恒溫保存箱中保存，每隔12 h輕輕搖動(dòng)精液1次。每隔24 h檢測精子各項(xiàng)指標(biāo)，直至精子活力低于0.60。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 精子活率采用10級(jí)制，在顯微鏡視野中估算直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子所占全部精子的百分?jǐn)?shù)。直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子為100%者評(píng)為1.0級(jí)，90%者為0.9級(jí)，以此類推。

1.4.2 精子質(zhì)膜完整性分別從6個(gè)錐形瓶中用移液槍吸取精液0.1 mL加入裝有1 mL果糖-檸檬酸鈉低滲溶液的試管中混勻，37℃水浴30 min后取出，室溫靜置1 min，吸取滴片10 μL，用高倍鏡（400×）鏡檢，每次至少記錄200個(gè)精子中彎尾的精子數(shù)量，計(jì)算精子質(zhì)膜完整率。

1.4.3 精子頂體完整性使用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的精子快速染色液，試劑盒采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的快速改良巴氏染色法，適用于精子形態(tài)檢查等。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作染色，最后在顯微鏡油鏡下觀察計(jì)數(shù)，并計(jì)算精子頂體完整性。

1.4.4 精子線粒體膜完整性使用Rh123和PI對(duì)精子進(jìn)行聯(lián)合染色后，在熒光顯微鏡下觀察精子發(fā)光情況：1）精子頭部核區(qū)發(fā)出紅色熒光：死精子；2）精子發(fā)出綠色熒光：線粒體膜功能良好的精子；3）精子同時(shí)發(fā)出兩種熒光：處于將要死亡的過渡狀態(tài)的精子。精子線粒體膜完整率=線粒體膜完整精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%。

架構(gòu)實(shí)習(xí)酒店管理體系，實(shí)習(xí)酒店的運(yùn)營者和教師共同擔(dān)任管理者，學(xué)生是服務(wù)員，教師擔(dān)任主管或部門經(jīng)理。專業(yè)教師或者職場師傅對(duì)學(xué)生實(shí)訓(xùn)現(xiàn)場表現(xiàn)進(jìn)行分析指導(dǎo)。不斷完善對(duì)校外實(shí)習(xí)基地的建設(shè)，已建成32家國內(nèi)外知名品牌的實(shí)習(xí)基地，這些教學(xué)實(shí)訓(xùn)基地為專業(yè)教學(xué)服務(wù)能力的提升提供了堅(jiān)實(shí)的保障。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步整理后，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)中黑豬鮮精品質(zhì)

經(jīng)測定，關(guān)中黑豬精液品質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，詳見表1。

表1 關(guān)中黑豬精液品質(zhì)鑒定結(jié)果

2.2 不同稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響

由表2可知，3種稀釋劑保存效果最好的是Ⅰ組，當(dāng)保存時(shí)間達(dá)5 d時(shí)精子活率仍然維持在0.7以上，顯著好于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）。3種稀釋劑在第1天對(duì)精子保存的效果差異不明顯（P＞0.05），但從第2天開始，Ⅰ組保存效果要明顯優(yōu)于Ⅱ組和Ⅲ組，而Ⅱ組和Ⅲ組的保存效果差異不顯著（P＞0.05）。

表2 3種稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子活率的影響

2.3 不同稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子質(zhì)膜完整率的影響

由表3可知，在所選用的幾種稀釋劑中，對(duì)關(guān)中黑豬質(zhì)膜完整性的保存效果最好的是Ⅰ組，其次為Ⅲ組，最差為Ⅱ組。在第1天和第2天時(shí)，Ⅱ組、Ⅲ組保存效果差異不顯著（P＞0.05），但從第3天開始，Ⅲ組保存效果要顯著優(yōu)于Ⅱ組（P＜0.05）。

2.4 不同稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子頂體完整率的影響

由表4可知，Ⅰ組對(duì)關(guān)中黑豬精子頂體完整性的保存效果好于其他兩組。第1天和第2天時(shí)，Ⅰ組、Ⅱ組保存效果差異不明顯（P＞0.05）；從第3天開始，Ⅰ組保存效果要顯著優(yōu)于Ⅱ組、Ⅲ組（P＜0.05），而Ⅱ組、Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 3種稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子質(zhì)膜完整率的影響

表4 3種稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子頂體完整率的影響

2.5 不同稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子線粒體膜完整率的影響

由表5可知，Ⅰ組對(duì)關(guān)中黑豬精子線粒體膜完整性的保存效果顯著好于其他兩組（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅲ組差異不顯著（保存第3天精子線粒體膜完整率除外）。

表5 3種稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精子線粒體膜完整率的影響

3 討論

目前，由于國外優(yōu)良瘦肉型豬種對(duì)國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的巨大影響，我國許多地方品種和培育品種的養(yǎng)殖均受到不同程度的沖擊。由于養(yǎng)殖規(guī)模小，諸如梅山豬等地方品種和關(guān)中黑豬等培育品種基本處于保種和本交狀態(tài)。但隨著消費(fèi)者態(tài)度的轉(zhuǎn)變，為促進(jìn)關(guān)中黑豬等豬種的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，人工授精技術(shù)的普及不可或缺，對(duì)于該豬種常溫保存稀釋劑的選擇顯得尤為重要。陳曉暢等設(shè)計(jì)了5種稀釋劑配方對(duì)關(guān)中黑豬精液在17℃的保存效果試驗(yàn)，篩選出最佳自配稀釋液[2]。本試驗(yàn)選取市售的3種常見稀釋劑，對(duì)關(guān)中黑豬精液進(jìn)行保存，根據(jù)保存效果判定篩選出最佳稀釋劑為日本某稀釋劑，這為后續(xù)關(guān)中黑豬的豬精液常溫保存和人工授精提供參考。邢軍等參考經(jīng)典配方Androhep、choffow和葡-檸-EDTA并略作完善，應(yīng)用于梅山豬精液17℃常溫保存，發(fā)現(xiàn)葡-檸-EDTA液保存的豬精子活率顯著低于前兩種稀釋液的保存效果[3]。此外，馬紅等、李玉芳等、邢軍等還分別對(duì)民豬、五指山豬、梅山豬和金華豬等地方豬種精液的冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了研究，對(duì)冷凍稀釋劑和保護(hù)劑進(jìn)行了篩選[3-8]。我國地方豬種和培育品種繁多，對(duì)于這諸多品種豬精液的保存研究工作還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

在人工授精過程中，精液的品質(zhì)對(duì)于母豬的繁殖性能有著很大的影響。因此，在鮮精采集后需要對(duì)精液進(jìn)行品質(zhì)檢測[9]，保證在其輸入母豬子宮后能發(fā)揮其正常功能，減少母豬空懷，從而提高母豬的繁殖性能。同時(shí)，精液品質(zhì)的好壞也能反映出種公豬的優(yōu)良程度，并依據(jù)此調(diào)整公豬的飼糧、飼養(yǎng)管理方式，或直接淘汰。本試驗(yàn)采得關(guān)中黑豬鮮精的平均密度和pH均大于陳曉暢等的試驗(yàn)數(shù)據(jù)而采精量較小，其原因可能與豬只個(gè)體狀況和季節(jié)有關(guān)。精液性狀是關(guān)中黑豬種公豬繁殖性能的一項(xiàng)重要參考依據(jù)，在將來的工作中可以考慮通過大量的實(shí)踐確定關(guān)中黑豬精液性狀標(biāo)準(zhǔn)。

精液品質(zhì)的鑒定主要包括采精量、顏色、pH、密度、活力、畸形率等指標(biāo)，檢測方法可以概括為感官檢測和顯微鏡檢測[10]。但是，不論是感官檢測還是顯微鏡檢測，對(duì)于指標(biāo)的判定，主要是以人為主觀來判定，極有可能會(huì)出現(xiàn)誤差，因此在精液品質(zhì)鑒定過程中，應(yīng)該增加樣本數(shù)以及取樣數(shù)，求其平均值，真實(shí)、客觀地反映出精液的品質(zhì)。

目前，豬精液在常溫條件下保存仍是最為常用的方法，而在這一過程中，稀釋劑扮演著至關(guān)重要的角色。稀釋劑一方面需要為精子提供其體外生存的營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖物質(zhì)、抗凍物質(zhì)等，以維持其形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征，另一方面還需要滿足生產(chǎn)上的需要，使精液的使用率最大化。本試驗(yàn)選取的3種市售稀釋劑，配方不同即其中所含的成分不同，對(duì)關(guān)中黑豬精液保存效果存在較大差異，其中日本某稀釋劑保存效果最佳，在保存第5天精子活率仍高于70%，而在其他兩種稀釋劑中保存的精子活率均低于60%，這可能與日本某稀釋劑中的抗氧化劑等特殊成分緊密相關(guān)。但不論何種品牌的稀釋劑，在對(duì)精液保存時(shí)，都必須保證精子的各項(xiàng)生理指標(biāo)都合格。一般而言，稀釋劑的成分，成分濃度、配比都會(huì)影響到稀釋劑對(duì)精液的保存效果。以葡萄糖為例，不僅能為精子的存活供給三磷酸腺苷（ATP）以及營養(yǎng)物質(zhì)，還能起到維持其滲透壓的作用，保持滲透壓的穩(wěn)定性[11]，此外，它還能起到保護(hù)精子質(zhì)膜完整性的作用。但有研究表明，如果稀釋劑中葡萄糖的濃度過高，則會(huì)對(duì)精子造成損傷[12]。pH和滲透壓的穩(wěn)定有利于稀釋劑對(duì)精子的保存，所以，常常加入一些如碳酸氫鈉（NaHCO3）、檸檬酸鈉、Tris、HEPES等緩沖物質(zhì)來調(diào)節(jié)稀釋劑的pH[13]，而滲透壓則可以通過添加葡萄糖之類的非離子物質(zhì)維持其穩(wěn)定。此外，在稀釋劑中添加適量的氯化鉀（KCl）能夠延長精子的保存時(shí)間，其原理在于一定濃度的鉀離子（K+）能維持精子膜上鈉鉀泵的運(yùn)轉(zhuǎn)，在膜外K+濃度較低的條件下，能夠產(chǎn)生ATP維持精子的活動(dòng)和生存。鈣離子（Ca2+）能啟動(dòng)精子獲能，這對(duì)精子的保存是極其不利的，因此，常常在稀釋劑中加入能夠螯合Ca2+的EDTA，從而減少進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，以達(dá)到預(yù)期保存效果。精液在保存的過程中，常常會(huì)受到細(xì)菌、真菌等污染物的污染，使精子出現(xiàn)畸變甚至死亡[14]。為此，稀釋劑中會(huì)加入抗生素以避免污染物對(duì)于精子的侵害，但由于抗生素濫用現(xiàn)象普遍存在，使得很多細(xì)菌、真菌對(duì)于抗生素有著極大的耐藥性[15]，因此開發(fā)新的抗菌藥物勢在必行。

4 結(jié)論

日本某稀釋劑對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果要明顯優(yōu)于比利時(shí)某稀釋劑和英國某稀釋劑。此外，在對(duì)精子活率、頂體完整率和線粒體膜完整率保存效果上，比利時(shí)某稀釋劑和英國某稀釋劑較為接近；而在對(duì)質(zhì)膜完整率的保存效果上，英國某稀釋劑要優(yōu)于比利時(shí)某稀釋劑。

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（編輯：富春妮）

The Effect of Guanzhong Black Pig's Semen Stored at Room Temperature in Three Commercial Extenders

LIU Zhaojun,XIE Jingxing,HOU Zhenkun,WEI Ning,YANG Gongshe,PANG Weijun
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China)

To evaluate the semen preservation effect of three kinds of commercial sperm extenders on Guanzhong black pig,we detected the sperm motility,membrane integrity,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity during sperm storage.Results showed that a certain kind of Japanese extender had the best preservation effect on Guanzhong black pig's sperm compared with the certain kind of Belgian extender and the certain kind of British extender(P＜0.05),the sperm motility of Japanese extender was 0.75,greater than 0.53 (Belgian extender group)and 0.51(British extender group)when save to 5 days.In addition,the preservation effect of Belgian extender and British extender on sperm motility,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity had no significant differences(P＞0.05).As for membrane integrity,the British extender group is better than the Belgian extender group(P＜0.05),Save to 5 days membrane integrity rates were 44.52%and 32.48%.

Guanzhong black pig;boar semen;commercial extenders;room temperature preservation

S828.3

A

1002-1957(2016)04-0033-04

2016-07-01

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站（基地）科技成果推廣項(xiàng)目（TGZX2015-18）

劉兆軍（1993-），男，江西吉安人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樨i人工授精技術(shù)的研究工作.E-mail:liuzhaojun＠nwsuaf.edu.cn

龐衛(wèi)軍（1972-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榧∪馍飳W(xué)與豬遺傳改良.E-mail：pwj1226＠nwafu.edu.cn