王先平，李 杰，韓厚偉，胡佳平，趙麗麗，邵 偉，王振洋

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264003 )

大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌組成的研究

王先平，李 杰，韓厚偉，胡佳平，趙麗麗，邵 偉，王振洋

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264003 )

采集養(yǎng)殖池水樣，選取Zobell 2216E瓊脂培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基6種常見固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，以平板菌落計(jì)數(shù)法和菌落外觀形態(tài)特征辨別及16S rRNA基因測(cè)序方法進(jìn)行異養(yǎng)菌計(jì)數(shù)和種類組成分析。結(jié)果顯示:(1)養(yǎng)殖池水體異養(yǎng)菌可分為4大類，分別屬于變形菌門(包括α-、γ-變形菌綱)、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，其中以γ-變形菌綱為優(yōu)勢(shì)菌群。按屬分類大多為假交替單胞菌屬和弧菌屬。(2)不同培養(yǎng)基分離菌落數(shù)量2216E培養(yǎng)基>溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基>胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基>腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基>營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基>硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，且2216E培養(yǎng)基菌落數(shù)極顯著高于其余5種培養(yǎng)基(P<0.01)；2216E培養(yǎng)基所分離細(xì)菌的種類最多，分屬于12個(gè)屬，假交替單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)類群，占比50%，弧菌屬僅占3.13%；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌均以弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，分別占33.33%、60%、25%；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌僅分屬于1個(gè)屬，即弧菌屬；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基無弧菌，但有假單胞菌分離出。

大西洋鮭；循環(huán)水養(yǎng)殖水體；異養(yǎng)細(xì)菌組成；不同培養(yǎng)基

大西洋鮭(Salmosalar)原產(chǎn)于大西洋北部和北美，是人工養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的冷水性魚類[1]。傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式多為網(wǎng)箱、流水或水庫養(yǎng)殖，而隨著農(nóng)業(yè)工業(yè)化的進(jìn)程，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)已經(jīng)成為一個(gè)越來越常見的養(yǎng)殖大西洋鮭的工業(yè)模式。但循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)在病害預(yù)警機(jī)制與預(yù)防策略等方面存在較大問題與不足[2]。目前關(guān)于養(yǎng)殖水循環(huán)處理效果的研究多集中于水質(zhì)理化指標(biāo)檢測(cè)和硝化細(xì)菌研究方面[3-5]，而對(duì)循環(huán)水養(yǎng)殖處理系統(tǒng)中細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化研究較少。異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的多寡可以反映水體中有機(jī)物的污染程度[6]，而對(duì)潛在病原菌的調(diào)查，對(duì)病害的發(fā)生有一定的預(yù)警指示作用[7]，因此對(duì)養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌組成研究有一定的意義。

微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累受制于培養(yǎng)基的組分等多種因子的影響[8]，因此選擇適宜的培養(yǎng)基尤為重要。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法通常采用營(yíng)養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基，以使微生物能夠快速生長(zhǎng)并達(dá)到最大的生物產(chǎn)量[9]，而自然界中除了少部分能夠利用高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的微生物種群外，其余大部分是以中低營(yíng)養(yǎng)甚至寡營(yíng)養(yǎng)的方式存活，如海洋環(huán)境中的微生物多為寡營(yíng)養(yǎng)型[10]，而同時(shí)某些潛在病原菌一般都是偏愛豐富營(yíng)養(yǎng)的種類，與環(huán)境水體菌的營(yíng)養(yǎng)需求存在差異。本研究旨在以大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體為研究對(duì)象，利用6種營(yíng)養(yǎng)成分不同的培養(yǎng)基，使用傳統(tǒng)的平板稀釋涂布法和現(xiàn)代分子測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的手段，分析研究養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌種類組成的情況、調(diào)查潛在病原菌的存在情況，并比較不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基所能分離培養(yǎng)的異養(yǎng)菌種類的差異，為大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖的病害工作提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)

試驗(yàn)地點(diǎn)在山東東方海洋科技股份有限公司開發(fā)區(qū)分公司，選擇一套大西洋鮭成魚養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行水樣采集。該系統(tǒng)為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(圖1)，養(yǎng)殖單元水體總體積為300 m3，共分為5口八角形池子，每池體積60 m3，水深2.5 m；水體鹽度28～30，深水井(深度約120 m)地下鹽水。養(yǎng)殖密度12.25 kg/m3，循環(huán)量450～500 m3/h，pH值7.0，水溫(15±0.2 ) ℃，溶解氧(2.94±1.70) mg/L。水樣采集期間養(yǎng)殖系統(tǒng)正常運(yùn)行，紫外燈5組正常開啟，臭氧3.5 L/min。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)構(gòu)造注：黑色箭頭示水流方向，虛線示備用管道.

1.1.2 培養(yǎng)基

所有培養(yǎng)基均是購自青島海博的商品化培養(yǎng)基成品，①Zobell 2216E瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨、酵母浸粉、檸檬酸鐵、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、瓊脂；②溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂；③硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基成分：酵母粉、蛋白胨、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉、牛膽酸鈉、蔗糖、氯化鈉、檸檬酸鐵、溴麝香草酚蘭、麝香草酚蘭、瓊脂；④腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、牛心浸出粉、瓊脂；⑤胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、大豆胨、氯化鈉、瓊脂；⑥營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、瓊脂。以上培養(yǎng)基均按指定方法配制后經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻傾倒滅菌平板。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水樣采集

選擇系統(tǒng)某一養(yǎng)殖池為采樣點(diǎn)，分別用水樣采集器在池中心、進(jìn)水口附近及池子另一端采集中層水樣3個(gè)(約水層下1.25 m處)。將水樣采集器內(nèi)水樣引流至采樣瓶?jī)?nèi)，搖晃瓶體洗滌2次，再將瓶體注滿，擰緊瓶蓋后瓶體噴灑75%酒精消毒，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 水樣預(yù)處理

從采樣瓶中吸取一定體積的水樣以溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按3∶1的體積比例稀釋后，170 r/min、28 ℃搖床活化1 h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇用無菌海水稀釋10倍，菌落數(shù)不影響計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

從試管中吸取200 μL已活化稀釋好的水樣分別滴加于2216E培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基6種培養(yǎng)基平板上，靜置數(shù)秒后用灼燒充分并已冷卻的玻璃涂布棒涂布均勻，每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)平行，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)和種類分析

分別于24、48、72、96 h，以計(jì)數(shù)器輔助統(tǒng)計(jì)平板菌落數(shù)，記錄成表。

在培養(yǎng)過程中，根據(jù)菌落的外部形態(tài)特征辨別菌落(菌落大小、顏色、透明度、邊緣是否規(guī)則、濕潤(rùn)或干燥菌落突起、凹陷或平坦等)，做好記錄，同時(shí)挑取不同形態(tài)菌落，劃線純化3次，并統(tǒng)計(jì)菌落的種類數(shù)量；最終分離菌株于超低溫冰箱-80 ℃凍存。

采用酚-氯仿法提取純化的各菌株基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電泳條件為100 V，30 min)。再以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F-1492R[11](由上海生工生物工程股份有限公司合成)擴(kuò)增16S rRNA基因序列，上游引物27F序列為：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，下游引物1492R序列為：5′-GGCTCCTTGTTACGACTT-3′。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并在253 nm波長(zhǎng)下觀察。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的BLAST檢索系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行同源序列比對(duì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18軟件對(duì)不同培養(yǎng)基在時(shí)間軸上的菌落數(shù)進(jìn)行單因素方差分析比較，以P<0.05為差異顯著；同時(shí)對(duì)各培養(yǎng)基最終菌落數(shù)進(jìn)行方差分析比較，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)所得異養(yǎng)菌菌株數(shù)量的比較

所采集水樣涂布于不同培養(yǎng)基平板，分別于24、48、72、96 h,對(duì)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)(圖2)，結(jié)果顯示,所分離平板菌落數(shù)量呈現(xiàn)2216E培養(yǎng)基>溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基>胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基>腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基>營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基>硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，其中2216E培養(yǎng)基分離的菌落數(shù)最高，為40～124 cfu，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而顯著增加(P<0.05)，且最終培養(yǎng)所得菌落數(shù)(96 h)極顯著高于其他5種培養(yǎng)基(P<0.01)。所分離菌落數(shù)溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基次之，為30～36 cfu，且隨時(shí)間增加變化不顯著(P>0.05)，其余4種培養(yǎng)基菌落數(shù)均較低，整體均處于20 cfu以下。

圖2 6種不同培養(yǎng)基于不同培養(yǎng)時(shí)間的平板菌落數(shù)注：數(shù)值為3個(gè)水樣平板菌落數(shù)的平均值，具有不同上標(biāo)字母的平均值間差異顯著(P<0.05).

2.2 養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌種類組成

經(jīng)外觀形態(tài)辨別后，挑選139株菌株經(jīng)16S rRNA基因通用引物做PCR分析后送測(cè)序，共獲得118條有效序列。BLAST分析結(jié)果可分為4大類，分別屬于變形菌門(包括α-、γ-變形菌綱)，厚壁菌門(僅芽孢桿菌綱)，擬桿菌門(僅黃桿菌綱)，放線菌門(僅放線菌綱)。其中以γ-變形菌綱細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)類群。所有菌株共分屬于24個(gè)屬，其中以假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的菌株最多，為32株，弧菌屬(Vibrio)菌株次之，為29株。

不同培養(yǎng)基間比較發(fā)現(xiàn)(圖3，表1)，除營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外，其余5種培養(yǎng)基均有弧菌屬細(xì)菌分離出，而假交替單胞菌僅2216E培養(yǎng)基分離出。其中：

① 2216E培養(yǎng)基所分離細(xì)菌送測(cè)80株，獲得64條有效序列，屬于變形菌門和擬桿菌門，分別占比93.75%和6.25%，屬于12個(gè)屬，假交替單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)類群，占比50%，弧菌屬占比3.13%。

② 溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基所分離細(xì)菌送測(cè)16株，獲得15條有效序列，屬于變形菌門和擬桿菌門，分別占比80%和20%，屬于3個(gè)屬，弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，占比60%。

③ 腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌共送測(cè)18株，獲得18條有效序列，屬于變形菌門和厚壁菌門，分別占比66.67%和33.33%，屬于5個(gè)屬，弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，占比33.33%。

④ 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌送測(cè)4株菌，獲得4條有效序列，屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，分別占比25%、50%、25%，屬于4個(gè)屬，弧菌數(shù)占25%。

⑤ 硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌送測(cè)13株，獲得11條有效序列，僅屬于1個(gè)屬，即變形菌門的弧菌屬。

⑥ 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基所分離細(xì)菌送測(cè)8株，獲得6條有效序列，屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，各占比1/3，屬于3個(gè)屬，無弧菌分離出。

圖3 各培養(yǎng)基所分離菌株的種類組成左：按門劃分，右：按屬劃分

表1 6種不同培養(yǎng)基上可培養(yǎng)細(xì)菌的屬/種類型

3 討 論

水細(xì)菌是水域生態(tài)系統(tǒng)重要的礦化者, 同時(shí)也作為初級(jí)生產(chǎn)力成為部分微型浮游動(dòng)物的餌料, 其活躍的代謝促進(jìn)了系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng),維系著一個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[12]。天然海水細(xì)菌種類多、分布廣，主要是弧菌科細(xì)菌、腸桿菌科細(xì)菌，其中尤以弧菌科數(shù)量最多[13-14]。而在養(yǎng)殖密集區(qū)水域，細(xì)菌類群種類比較豐富，它們多屬于假交替單胞菌屬和弧菌屬[15-16]，同時(shí)多數(shù)假單胞菌在工農(nóng)業(yè)污水處理、消除環(huán)境污染中起重要作用[17-18]。本研究對(duì)大西洋鮭養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細(xì)菌組成分析發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌屬和弧菌屬所屬細(xì)菌最多，可認(rèn)為是大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體的兩類優(yōu)勢(shì)菌群。而變形菌門和厚壁菌門所占比最大，也與大菱鲆(Scophthalmusmaximus)養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)門組成一致[19]。

海水細(xì)菌與淡水或土壤細(xì)菌不同，大多數(shù)海水細(xì)菌為嗜鹽性菌，分解蛋白能力強(qiáng)，而分解糖能力較弱，能生長(zhǎng)在低營(yíng)養(yǎng)和低溫環(huán)境中。由于海水細(xì)菌的特殊性，分離培養(yǎng)海水細(xì)菌需要特殊培養(yǎng)基，且海水細(xì)菌在分離及傳代過程中易發(fā)生變異和死亡，給海水細(xì)菌研究工作帶來一定困難[13]。2216E培養(yǎng)基作為高鹽度寡營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)適合海水環(huán)境菌的生長(zhǎng)，所培養(yǎng)的異養(yǎng)菌菌落數(shù)極顯著高于其他5種培養(yǎng)基(P<0.01)，且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而顯著增加(P<0.05)，尤其假交替單胞菌在該環(huán)境下生長(zhǎng)迅速，占50%，為養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群。據(jù)文獻(xiàn)記載，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的含量最好與微生物自然生長(zhǎng)環(huán)境相近[9]，且低含量基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌在數(shù)量和種類上均多于高含量基質(zhì)的培養(yǎng)基[20]，本研究中，高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板中菌落數(shù)<20 cfu，分離細(xì)菌分屬于5個(gè)屬，低于2216E培養(yǎng)基所分離培養(yǎng)的菌落數(shù)和種類數(shù)，說明在寡營(yíng)養(yǎng)的海水環(huán)境中的異養(yǎng)細(xì)菌不易在溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但同時(shí)分離出3株芽孢桿菌屬細(xì)菌，均為對(duì)水體有機(jī)物有強(qiáng)烈分解能力的水體異養(yǎng)細(xì)菌。

養(yǎng)殖水體潛在病原菌情況的調(diào)查，對(duì)病害預(yù)警有一定的指示作用[7]。在除營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外的5種培養(yǎng)基均有弧菌分離出，說明其在大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體中廣泛存在，為優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離得到假單胞菌屬細(xì)菌，該種屬包括熒光假單胞菌(P.fluorescens)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)等致病性較強(qiáng)的水產(chǎn)動(dòng)物病原菌[11]，因此作為潛在病原菌，其數(shù)量的監(jiān)測(cè)和控制措施的制定均值得重視。

本文研究了大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體的異養(yǎng)細(xì)菌的種類組成，為循環(huán)水養(yǎng)殖水質(zhì)凈化和病害預(yù)警提供了一定的參考資料。后續(xù)研究應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查取樣點(diǎn)，研究循環(huán)水不同水處理環(huán)節(jié)的異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量和種類組成差異，為進(jìn)一步豐富病害預(yù)警理論、評(píng)價(jià)循環(huán)水系統(tǒng)水處理效果提供數(shù)據(jù)支持。

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CompositionofHeterotrophicBacteriainaRecirculatingAquacultureSystemforAtlanticSalmon(Salmosalar)

WANG Xianping，LI Jie，HAN Houwei，HU Jiaping，ZHAO Lili，SHAO Wei, WANG Zhenyang

( Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co., Ltd，Yantai 264003，China )

The aim of this work was to study the composition of heterotrophic bacteria in a Recirculating Aquaculture System(RAS)for Atlantic salmon (Salmosalar) and to compare the difference in bacterial isolation and cultivation in different culture media. The bacteria in water samples collected from the tanks were cultured in 6 types of medium including 2216E, BHI, LB, NA, TSA, and TCBS, and composition and quantity of the bacteria were determined by a plate count method, bacterial morphological identification and 16S rRNA gene sequencing analysis method. It was found that the heterotrophic bacteria in the tank water were divided into 4 major groups: Proteobacteria (including the α-,γ-Proteobacteria)，F(xiàn)irmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria, with the dominant γ-Proteobacteria, especially the generaPseudoalteromonasandVibrio. The plate colony numbers in different media were shown as the order of 2216E >LB >TSA>BHI>NA>TCBS，significantly higher in the 2216E than in the other 5 culture media (P<0.01). The bacteria isolated from 2216E culture medium belonged to 12 genera, the maximal becteria in genusPseudoalteromonasin accounting for 50% and genusVibriorepresenting only 3.13%. The genusVibriowas the dominant genus in various culture media, accounting for 33.33% in BHI, 60% in LB, 25% in TSA and 100% in TCBS (only one genusVibrio), but noVibriobutPseudomonaswas isolated from NA culture mediuma.

Atlantic salmon (Salmosalar); recirculating aquaculture system(RAS); composition of heterotrophic bacterium; different culture medium

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.003

S943

A

1003-1111(2016)03-0210-05

2015-07-08；

2015-10-08.

國(guó)家國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2014DFA31030).

王先平(1987-)，男，助理工程師,碩士；研究方向：循環(huán)水養(yǎng)殖病害防控技術(shù).E-mail：wxp_606@163．com.通訊作者：韓厚偉(1981-)，男，工程師，碩士；研究方向：循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù).E-mail：hanhouwei@163.com.