王宏婷，何丹，王存琴，邵海彬，尚文龍，王宏梅，葉靈

（1.皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

論著

枸骨葉水提物對高脂小鼠膽固醇合成代謝的影響*

王宏婷1，何丹2，王存琴2，邵海彬2，尚文龍2，王宏梅2，葉靈2

（1.皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

目的探討枸骨葉水提物對高脂小鼠血清膽固醇水平及合成代謝信號(hào)通路的影響機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分5組，其中3組用高、中、低劑量枸骨葉水提物灌胃30d后，測其血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，并與辛伐他汀組進(jìn)行比較；采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）肝臟細(xì)胞中3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）；采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）的表達(dá)。結(jié)果枸骨葉高、中、低劑量組有降低TC的作用（P＜0.01），與辛伐他丁組降低TC作用無差異；此外枸骨葉組均可降低HMG-CoA水平，降低肝細(xì)胞中p-EGFR的表達(dá)。結(jié)論枸骨葉水提物對高脂飲食小鼠在清除TC方面發(fā)揮重要作用，它降低肝細(xì)胞中p-EGFR的表達(dá)，抑制HMG-CoA活性，進(jìn)而降低高脂飲食小鼠體內(nèi)TC水平而發(fā)揮降血脂作用。

枸骨葉；3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）；表皮生長因子受體；高脂血癥

高脂血癥已成為威脅人類健康的主要疾病之一。目前，臨床用于治療高脂血癥的西藥具有很多不良反應(yīng)。因此，以中草藥為代表的植物藥以及生長、代謝過程中產(chǎn)生的具有特殊生理活性且結(jié)構(gòu)多樣的植物次生代謝產(chǎn)物成為天然藥物研究者高度關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。

枸骨葉作為苦丁茶藥材的主要來源，具有降低血脂的功效[2-3]，現(xiàn)代藥理研究表明，枸骨葉具有降血脂、抗心肌缺血、抗氧化、抗菌、免疫抑制、抗生育等作用[4-11]，并且毒性很低[12]，但降脂機(jī)制尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過動(dòng)物學(xué)、分子生物學(xué)方法測定高血脂模型小鼠飲用枸骨葉水提物后血脂水平的改變，并通過對小鼠肝臟內(nèi)磷酸化表皮生長因子受體（phosphorylation-epidermal growth factor receptor，p-EGFR）的表達(dá)，探究分子水平上降血脂的作用機(jī)制，為枸骨葉降血脂的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10周齡雄性昆明小鼠由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證：Scxk（蘇）2011-0003。70只，體重（25±2）g左右。

1.2 材料與試劑

干燥的枸骨葉，一般基礎(chǔ)飼料，高脂飼料（含豬油10%、膽固醇2%、牛膽鹽0.2%和蛋黃粉10%），小鼠墊料，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。3%～5%的苦味酸溶液（用75%的乙醇溶解），血脂四項(xiàng)試劑盒（南京建成生物工程研究所），p-EGFR（Tyr1608）XP Rabbit mAb、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG和內(nèi)參蛋白GAPD（美國Cell Signalling公司），3-羥基-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司），蛋白濃度測量試劑盒（BCA）和化學(xué)發(fā)光試劑盒（HRP-ECL）（碧云天生物科技研究所），PVDF膜（美國Immobilon）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗），熒光紫外凝膠成像系統(tǒng)Fluor ChemQ（美國ALPHA），5417R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf），電磁爐（中國Suboe），鋁合金煎煮鍋（定制），粉碎機(jī)（中國中誠制藥機(jī)械XFB-500），電子天平（中國富朗FA2004）。

1.4 方法

1.4.1 枸骨葉水提物的制備干燥的枸骨葉粉碎成粗粉，每次稱取適量的枸骨葉15倍水浸泡20 min，煎煮1 h，加水煎煮2次，合并煎煮液，過濾，減壓濃縮后靜置過夜，將提取液離心后取其上清液（相對密度約為1.05），經(jīng)D101型大孔吸附樹脂，依次用水，45%、75%和95%乙醇梯度洗脫，取95%、75%和45%乙醇洗脫部位浸膏，得到不同濃度的乙醇水提物半固體浸膏，使每1 ml含原生藥1 g。按高劑量組12 g/kg，中劑量組8 g/kg，低劑量組4 g/kg[13-14]（注：按照大鼠和小鼠的換算系數(shù)為2計(jì)算）分別量取不同體積的枸骨葉水提物待用。

1.4.2 辛伐他汀溶液的配制取5 mg辛伐他汀片劑溶于30 ml 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中配成濃度為0.167mg/ml的均勻混懸液，供實(shí)驗(yàn)小鼠灌胃使用。

1.4.3 動(dòng)物分組與給藥小鼠適應(yīng)性觀察1周，用一般小鼠飼料喂2周，使其體重增長至平均體重30 g左右。隨機(jī)分為空白對照組、高脂模型組、高劑量枸骨葉組（12 g/kg）、中劑量枸骨葉組（8 g/kg）、低劑量枸骨葉組（4 g/kg）、辛伐他汀對照組。實(shí)驗(yàn)期間空白對照組小鼠給予一般飼料，其余5組給予含2%膽固醇的高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)2周后用枸骨葉水提物灌胃，高、中、低枸骨葉組分別給予12、8和4 g/kg枸骨葉，辛伐他汀組給予4.11 mg/kg的辛伐他汀[14]（注:根據(jù)人和小鼠的換算系數(shù)為12.33計(jì)算，辛伐他汀的一般規(guī)格為20mg/d，人均體重60kg）。各組小鼠分別灌胃給藥4周，剪尾取血，測其血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）含量，并取小鼠肝臟測定肝臟p-EGFR水平。

1.4.4 TC和TG的測定70只小鼠用剪尾的方法依次取血，放入1.5 ml試管中，室溫血液自然凝固10～20 min，離心20 min左右（2 000～3 000 r/min），取上清液。在微量加樣板上設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組均取2.5μl的上清液加入待測樣品孔中，空白孔加入等量的蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)孔加入等量的標(biāo)準(zhǔn)液，再依次加入相應(yīng)的工作液，混勻，37℃孵育10 min，在規(guī)定波長下，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算出TC和TG含量（具體操作見說明書）。

1.4.5 HMG-CoA的測定取小鼠血清（方法同上），在酶標(biāo)包被板上進(jìn)行加樣，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，待測樣品孔中先加樣品稀釋液50μl，然后再加待測樣品10μl，加樣時(shí)樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)，混勻，標(biāo)準(zhǔn)孔加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液，空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余操作相同。加樣后用封板膜封板后置37℃溫育30 min，孵育完畢進(jìn)行洗滌，小心揭掉封板膜棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外，再次溫育、洗滌（操作同上），然后進(jìn)行顯色，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μl終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色），以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度值（OD值），用吸光度值代入相關(guān)公式計(jì)算得出HMG-CoA的含量。

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）取適量肝臟勻漿液加入細(xì)胞裂解液，以4℃、12 000 r/min高速離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整上樣量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），200 V恒壓濕轉(zhuǎn)150 min，含3%牛血清蛋白（BSA）的Tris-HCL緩沖液室溫封閉2 h。加入特異性抗體（phospho-EGFR XPS Rabbit mAb）（1∶1 000稀釋），4℃過夜。HRP偶聯(lián)的羊抗兔免疫球蛋白IgG作為二抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（HRP-ECL）進(jìn)行發(fā)光成像，于熒光-紫外凝膠成像系統(tǒng)中曝光3～10 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂血癥小鼠模型

高脂模型組與空白對照組比較，高脂模型組的膽固醇含量高于空白對照組，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.590，t=4.741，P=0.006）（見表1），而高脂模型組的TG水平比空白對照組低，TG水平未升高。

表1 高脂血癥小鼠模型的復(fù)制（n=12，mmol/L±s）

表1 高脂血癥小鼠模型的復(fù)制（n=12，mmol/L±s）

注：?與空白對照組比較，P＜0.05

組別TCTGt值P值空白對照組3.242±0.3033.201±1.665 4.7410.006高脂模型組8.341±1.341?1.281±0.212

2.2 枸骨葉水提物對小鼠TC水平的影響

高、中、低劑量枸骨葉組TC含量比高脂模型組低，且結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.471，P高=0.036，t高=3.177，P中=0.009，t中=3.736，P低=0.047，t低= 2.888）（P＜0.05），枸骨葉水提物能有效降低小鼠體內(nèi)的TC（見表2）。

表2 枸骨葉水提物對小鼠TC水平的影響（mmol/L±s）

表2 枸骨葉水提物對小鼠TC水平的影響（mmol/L±s）

注：?與高脂模型組比較，P＜0.05

組別例數(shù)TCt值P值空白對照組123.242±0.303高脂模型組128.341±1.341高劑量枸骨葉組114.053±0.879?3.1770.036中劑量枸骨葉組123.194±0.506?3.7360.009低劑量枸骨葉組113.454±0.571?2.8880.047辛伐他汀組123.732±0.921?2.7830.032

2.3 枸骨葉水提物對小鼠HMG-CoA的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各枸骨葉給藥組的HMG-CoA水平均降低（F=2.435，P高=0.001，t高=8.533，P中=0.008，t中=4.770，P低=0.027，t低=3.407），提示枸骨葉水提物可能通過抑制HMG-CoA的表達(dá)來減少內(nèi)源性TC的合成，使小鼠血清中TC水平下降。見表3。

表3 枸骨葉水提物對小鼠HMG-CoA的影響（±s）

表3 枸骨葉水提物對小鼠HMG-CoA的影響（±s）

注：1）與高脂模型組比較，P＜0.01；2）與高脂模型組比較，P＜0.05

組別例數(shù)HMG-CoAt值P值空白對照組1210.232±2.471高脂模型組1214.344±2.442高劑量枸骨葉組114.051±1.4731）8.5330.001中劑量枸骨葉組128.191±2.5031）4.7700.008低劑量枸骨葉組1110.454±1.5722）3.4070.027辛伐他汀組126.321±1.3221）4.2340.007

2.4 枸骨葉水提物對小鼠肝臟p-EGFR表達(dá)的影響

高脂模型組與空白對照組p-EGFR表達(dá)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.792，t=2.849，P= 0.044），高脂模型組EGFR磷酸化水平更高。枸骨葉高劑量組與高脂模型組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.209，t=3.073，P=0.037），高劑量組肝臟細(xì)胞內(nèi)的p-EGFR水平降低，并且從附圖中可以看到高、中、低劑量組的趨勢。高劑量組p-EGFR的表達(dá)與辛伐他汀組比較，辛伐他汀無抑制小鼠肝臟p-EGFR表達(dá)水平的作用。

附圖枸骨葉水提物對小鼠肝臟p-EGFR的影響（n=3±s）

3 討論

EGFR是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，對EGFR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[15]。EGFR磷酸化反映該信號(hào)通路被激活，肝細(xì)胞p-EGFR可促進(jìn)肝細(xì)胞TG、膽固醇、LDL合成[16-18]。因此探究枸骨葉提取物對肝臟EGFR信號(hào)通路的影響有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。本次實(shí)驗(yàn)通過對高血脂小鼠灌胃枸骨葉，發(fā)現(xiàn)其具有降低小鼠膽固醇的作用；此外，還從分子水平上探究其發(fā)生的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂模型組與空白對照組比較其TC含量明顯升高（P＜0.05），提示高脂模型EGFR信號(hào)通路激活并促進(jìn)肝臟合成TG，游離膽固醇的釋放增多[19]，進(jìn)一步說明高脂模型造模成功，但TG水平未升高，這可能與其在體內(nèi)的分布情況有關(guān)，小鼠體內(nèi)含有大量的脂肪組織，當(dāng)一次性或長期攝入過多的高脂類飼料，體內(nèi)的脂肪組織會(huì)暫時(shí)把它貯存起來，一旦脂溶性的外來物進(jìn)入脂肪組織就很難釋放出來，在體內(nèi)長期蓄積，所以血清中游離的TG水平就顯著降低，筆者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示高脂模型組TG水平比空白對照組低。HMG-CoA是膽固醇合成限速酶，在膽固醇的合成中起著決定性作用[20]。筆者進(jìn)一步檢測HMG-CoA水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各給藥組HMG-CoA含量降低，與高脂模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在肝臟細(xì)胞內(nèi)，EGF通常與EGFR特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的生長、增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡和神經(jīng)活動(dòng)等所有的生命過程[21]。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明給藥組小鼠肝臟內(nèi)磷酸化的EGFR表達(dá)較空白對照組低，提示枸骨葉水提物可能通過影響肝臟細(xì)胞內(nèi)EGFR的磷酸化，調(diào)控EGFR通路以抑制HMG-CoA表達(dá)，進(jìn)而降低血清膽固醇水平。

綜上所述，枸骨葉水提物通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)EGFR的磷酸化水平，調(diào)控EGFR下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而使膽固醇的合成限速酶HMG-CoA合成受阻，降低血清膽固醇水平。

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（申海 菊編輯）

Influence of Iiex cornuta extracts on constructive metabolism of cholesterol in high-fat mice*

Hong-ting Wang1,Dan He2,Cun-qin Wang2,Hai-bin Shao2, Wen-long Shang2,Hong-mei Wang2,ling Ye2
(1.School of Preclinical Medicine,2.School of Pharmacy,Wannan Medical College, Wuhu,Anhui 241000,China)

Objective To evaluate the potential synergistic effect of Iiex cornuta or its essential component on serum cholesterol level and metabolism signal pathway of high-fat diet mice.Methods The mice were divided into 5 groups in random.Three groups took Iiex cornuta orally with different doses for 30 days.After that,serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)and low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)were measured,and compared with those in Simvastatin group.The level of 3-hydroxy-3-methyl glutaric acid acyl coenzyme A(HMG-CoA)in liver cells was measured by ELISA. The expression of phosphorylated epithelial growth factor receptor(p-EGFR)in liver cells was detected by Western blot.Results Serum total cholesterol was lowered in the Iiex cornuta groups with different doses(P＜0.01).This effect was similar to that of the Simvastatin group.In addition,the HMG-CoA level obviously declined in the Iiex cornuta groups.The p-EGFR expression in the liver cells of the Iiex cornuta groups decreased compared to that of the control group.Conclusions Iiex cornuta plays an important role in clearing serum total cholesterol in the mice of high-fat diet.It can lower the expression of p-EGFR,inhibit the activity of 3-hydroxy-3-methyl glutaric acid acyl coenzyme A in liver cells and then reduce serum total cholesterol in the high-fat diet mice.

Iiex cornuta;HMG-CoA;epithelial growth factor receptor;hyperlipemia

R589.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.001

1005-8982（2016）23-0001-05

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金（No：81402818）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（No：KJ2010B246，KJ2014A268）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（No：gxyqZD2016177）；安徽省高校優(yōu)秀中青年骨干人才國內(nèi)外訪學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No：gxfxZD2016161）；安徽省國家級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（No：201410368014）

王存琴，E-mail：wcq5188b@163.com；Tel：0553-3932497