程世越，李智，盧建紅，左埒蓮

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008；2.中南大學(xué)腫瘤研究所，湖南 長沙 410078）

論著

EBERs對鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用及其機制研究

程世越1，李智1，盧建紅2，左埒蓮2

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008；2.中南大學(xué)腫瘤研究所，湖南 長沙 410078）

目的探討EBERs對鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用及其機制。方法在鼻咽癌細胞中轉(zhuǎn)染EBERs，熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)（如MMP）的相對表達量，同時Transwell檢測EBERs對鼻咽癌細胞遷移能力的影響。構(gòu)建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞，檢測細胞的轉(zhuǎn)移能力。轉(zhuǎn)染EBERs后Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)指標(biāo)，免疫熒光檢測ZO-1的表達。結(jié)果鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染EBERs質(zhì)粒或p2089質(zhì)粒后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)表達升高，Transwell檢測結(jié)果顯示細胞遷移能力增強，而在干擾EBERs或轉(zhuǎn)染敲除EBERs的p2089質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)移能力減弱。轉(zhuǎn)染EBERs后E-cadherin表達降低，Vimentin升高，同時免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)ZO-1表達降低。結(jié)論EBERs可能通過促進EMT高表達而促進鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。

EBERs；鼻咽癌；轉(zhuǎn)移；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

EBV屬于人嗜淋巴γ皰疹病毒，在人群中的感染率高達95%，與鼻咽癌（NPC）、胃癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤有較強的相關(guān)性。EBV能夠合成2種非編碼RNA（EBERs）即EBER1和EBER2，分別由167和172個核苷酸組成，它們是在EBV感染多種細胞（淋巴細胞、鼻咽或胃上皮細胞）后的3個潛伏期中表達量最高的轉(zhuǎn)錄本，豐度高達107/細胞[1]，臨床上可以作為檢測EBV感染的指標(biāo)[2]。EBERs在EBV感染的細胞中普遍存在，但其在體內(nèi)的生物學(xué)功能卻較為復(fù)雜，已有報道證實，EBERs能夠促進淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其在其他包括鼻咽癌在內(nèi)的相關(guān)腫瘤中的功能仍不明確。鼻咽癌是一種具有高發(fā)病率和致死率的頭頸部腫瘤，在流行地區(qū)被證實均有EBV的感染。有研究證實，鼻咽癌的發(fā)生與EBERs有一定相關(guān)性[3]，但并未明確二者之間的因果關(guān)系。本研究旨在探討EBERs是否能夠促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移及其作用機制，為鼻咽癌臨床治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系

鼻咽癌細胞系CNE1、HNE1、6-10B、C666-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），并加入100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

pcDNA3.1-EBERs 10拷貝質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建和保存，BAC質(zhì)粒、含EBV B95-8株全基因組的BAC質(zhì)粒（BAC-EBV）p2089由德國GSF國家環(huán)境與衛(wèi)生研究中心的Hammerschmidt教授惠贈，p2089敲除EBERs質(zhì)粒的構(gòu)建流程如下[4-5]。

1.2.1 引物設(shè)計EBER1同源重組正向引物：CCC AAGCTTGACGTAGTCTGTCTTGAGGAAGGCTGGAG CTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCATCCTAAAA CAAAAGTTTGGTCTAGAGTCGACCTGCAGTTCG；E BER2同源重組正向引物：CCCAAGCTTTAGAGTTA CGGTTCGCTACAAGGCTGGAGCTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCGTGGGTGCAAAACTAGCCACTCT AGAGTCGACCTGCAGTTCG。

1.2.2 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌的準(zhǔn)備首先將表達重組蛋白redαβγ的溫敏質(zhì)粒pKD46按化學(xué)方法轉(zhuǎn)化至含p2089質(zhì)粒的大腸桿菌中，得到p2089-pKD 46細菌，30℃培養(yǎng)，具有氯霉素（Cam）和氨芐青霉素（Amp）抗性，將該細菌制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。

1.2.3 EBERs重組片段的線性轉(zhuǎn)化將純化的EBERs重組PCR片段100 ng電轉(zhuǎn)化至BAC-pKD46感受態(tài)細胞中，30℃、180 r/min培養(yǎng)2 h，離心后將菌液涂板與含卡那霉素（Kan）的LB培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)過夜后37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將具有Kan抗性的菌落在含有Kan和Cam的LB培基中42℃培養(yǎng)24 h以消除pKD46質(zhì)粒。

1.2.4 切除重組體中的Kanr基因?qū)⒅亟M后線性轉(zhuǎn)化的細菌制成感受態(tài)細胞，將表達重組蛋白FLP的溫敏質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，在含有Amp的LB培養(yǎng)板上30℃培養(yǎng)48h，挑取菌落至含Cam的LB培基中，42℃培養(yǎng)以消除pCP20，將只有Cam無Kan和Amp的菌液在含有Cam的LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)以純化細菌。

1.3 Transwell遷移實驗

實驗使用8 μm孔徑的24孔板Transwell小室（Coring，NY，USA）。提前將Transwell小室預(yù)冷，在上室中加入100μl稀釋的Matrigel（用RPMI 1640稀釋10倍，BD Biosciences，San Diego，CA），4℃靜置10min后將Matrigel吸走，37℃放置1h。細胞消化計數(shù)后將3×104個細胞重懸于200 μl無血清培基中并加入上室，下室加入700 μl完全培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)48h后取出小室，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后進行細胞計數(shù)。

1.4 熒光定量PCR

鼻咽癌細胞按照Trizol法提取RNA，使用Prime Scrip RT reagent kit with gDNA Eraser（TaKaRa& Clontech，Japan）進行逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR根據(jù)CFX-96 PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）要求配制反應(yīng)體系（見附表）。

附表引物及siRNA序列

續(xù)附表

1.5 Western blot

細胞加入適量蛋白裂解液RIPA，冰上裂解30 min，4℃離心10 629 r/min離心15 min，BCA法測蛋白濃度按照Thermo Pierce公司的說明書進行操作。將蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE電泳分離，再將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h，將一抗E-cadherin、Vimentin、Tubulin（Cell Signaling Technologies，Danvers，MA，USA）4℃孵育過夜，第2天二抗室溫孵育1 h，用Pierce公司的發(fā)光液對膜上蛋白顯影，Biorad成像儀成像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，t檢驗為雙側(cè)檢驗，Transwell的相對細胞數(shù)用Image J 4.2進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染EBERs后轉(zhuǎn)移能力增加

EBERs表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EBV陰性的鼻咽癌細胞CNE1-con、6-10B-con和HNE1-con 48 h后，Transwell檢測細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，EBERs能夠增強鼻咽癌細胞的侵襲能力（見圖1A）。同時通過比較細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)，EBERs對鼻咽癌細胞的增殖能力無明顯影響（見圖1B）。

2.2 敲除EBERs的p2089質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計并利用EBER1和EBER2敲除引物從pKD13質(zhì)粒上PCR擴增兩側(cè)帶有FRP重組位點的Kanr基因，瓊脂糖凝膠電泳證實攜帶有EBER兩側(cè)同源臂的Kanr基因擴增成功（見圖2A）。該片段電轉(zhuǎn)化至攜帶有EBV質(zhì)粒p2089和同源重組酶表達質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌BAC-46，Kan篩選后經(jīng)PCR檢測證實EBER被成功敲除（見圖2B）。進一步轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒去除Kanr基因，Kanr基因引物進行PCR鑒定，證實Kanr基因已經(jīng)從重組質(zhì)粒上切除（見圖2C）。

2.3 EBERs促進鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達

鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染EBERs 48 h后PCR檢測發(fā)現(xiàn)EBERs可以促進ITGB3在CNE1和HNE1中的表達，MMP2在CNE1和HNE2中的表達，以及MMP13在CNE1、HNE1和HNE2中的表達（見圖3A）。在EBV陽性的鼻咽癌細胞C666-1中用siRNA干擾EBER1和EBER2（siRNA序列見附表），PCR檢測結(jié)果可以看出ITGB3、MMP2、MMP13降低（見圖3B），從而反向驗證EBERs具有促進鼻咽癌轉(zhuǎn)移的作用。

圖1 EBV陰性鼻咽癌細胞瞬轉(zhuǎn)EBERs后細胞的遷移和增殖能力

圖2 從p2089質(zhì)粒成功切除EBERs基因

在EBV陰性的鼻咽癌細胞CNE2中轉(zhuǎn)染p2089及敲除EBERs的p2089質(zhì)粒，48 h后PCR檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，可以觀察到MMP2、MMP3、MMP9在轉(zhuǎn)染p2089后升高，而敲除EBERs后則抑制p2089質(zhì)粒對MMP2、MMP3、MMP9基因表達的上調(diào)（見圖3C）。

2.4 EBERs促進鼻咽癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

EBV陰性的6-10B細胞中轉(zhuǎn)染EBERs后，細胞形態(tài)由短小的橢圓形變成周圍有細長角的不規(guī)則形，且細胞之間的黏附變得松散（見圖4A），這種形態(tài)改變被認(rèn)為是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的典型過程。Western blot驗證EMT相關(guān)分子的變化（見圖4B），發(fā)現(xiàn)EBERs的表達使得E-cadherin降低，Vimentin升高，同時免疫熒光檢測結(jié)果顯示ZO-1的表達低于對照組（見圖4C）。

圖3 EBERs促進鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達（±s）

圖4 EBERs促進鼻咽癌細胞6-10B的EMT表型和相關(guān)基因表達

3 討論

鼻咽癌在我國南方高發(fā)，EBV是鼻咽癌的致病因素之一。EBERs是EBV編碼的非翻譯RNA在EBV潛伏感染階段豐度最高的轉(zhuǎn)錄本，具有獨特的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。自1981年首次發(fā)現(xiàn)EBERs以來，EBERs的研究重點主要在其二級結(jié)構(gòu)、結(jié)合蛋白，以及對細胞的轉(zhuǎn)化功能，潛伏致癌性[6]，但EBERs的具體功能仍不明確。EBERs在EBV致病的傳染性單核細胞增多癥以及一些EBV相關(guān)的腫瘤如鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤中表達[7]，早在90年代日本研究團隊已經(jīng)證實，EBV可以促進Burkitt淋巴瘤細胞Akata的發(fā)生、發(fā)展以及增加抗凋亡能力，其后他們又進一步證實，EBERs對Akata細胞的這些改變也同樣產(chǎn)生作用[8]，在EBV陰性的Akata細胞中過表達EBERs，細胞軟瓊脂克隆形成能力、抗凋亡能力增強，癌基因Bcl-2升高，并且認(rèn)為EBERs的這些功能可能與PKR相關(guān)。此后，EBERs對腫瘤的相關(guān)功能研究也逐漸增多，但主要是針對淋巴瘤進行探討，對鼻咽癌、胃癌的研究較少。

EBERs與鼻咽癌的相關(guān)性研究較少且不深入，早期有研究表明EBERs可以作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的一個分子指標(biāo)[9]，而較近的研究通過鼻咽癌臨床樣本實驗分析[10]，提示EBERs的高表達可能作為鼻咽癌預(yù)后較好的一個指標(biāo)，與之前的結(jié)論相互矛盾。因此，EBERs在鼻咽癌中發(fā)揮何種功能至今沒有明確結(jié)論。本研究從細胞層面探討EBERs是否能夠促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移。筆者在鼻咽癌細胞中瞬時轉(zhuǎn)染EBERs，觀察到鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，但是對其增殖沒有明顯影響，PCR檢測表明轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2、MMP3等均顯著上升，同時在C666-1細胞中通過干擾EBERs反向驗證以上結(jié)論。為了進一步驗證EBV基因組中的EBERs對鼻咽癌的作用，筆者引入EBERs敲除的p2089質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞，同樣證實EBERs能夠促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移能力及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。

發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞需脫離相鄰的細胞而進入周圍環(huán)境中，這需要腫瘤細胞失去細胞-細胞間黏附并獲得極性，其中EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。發(fā)生EMT時上皮細胞向可游離的間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，細胞形態(tài)由鵝卵石樣向梭形轉(zhuǎn)變，細胞分子發(fā)生改變。腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移可由EMT介導(dǎo)的結(jié)論在過去的研究中已經(jīng)很明確，例如RU等[11]研究的miRNA-29b可以通過抑制EMT從而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移；EMT在鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[12]。通過實驗證實鼻咽癌細胞系6-10B瞬轉(zhuǎn)EBERs后形態(tài)發(fā)生改變，與EMT的經(jīng)典表型一致，通過Western blot及免疫熒光進一步驗證EBERs能夠促進EMT相關(guān)分子的表達。

綜上所述，EBERs能夠促進鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移，并且該過程可能是通過EMT介導(dǎo)，本結(jié)果將為鼻咽癌抗復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的臨床治療提供新的潛在靶點。

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（申海菊 編輯）

EBERs promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma via epithelial-mesenchymal transition

Shi-yue Cheng1,Zhi Li1,Jian-hong Lu2,Lie-lian Zuo2
(1.Center for Molecular Medicine,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha, Hunan 410008,China;2.Cancer Research Institute,Central South University, Changsha,Hunan 410078,China)

Objective To investigate whether EBV encoded RNAs(EBERs)could promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma(NPC)and the possible involvement of epithelial-mesenchymal transition(EMT)in this process.Methods EBERs expression plasmid was transfected into EBV negative NPC cell lines with lipofectamine 2000.48 h after transfection,matrigel migration assay and cell counting were conducted to explore the impact of EBERs on NPC migration and proliferation,respectively.In addition,siRNA targeting EBERs was applied to EBV positive C666-1 cells,after that the expression changes of metastasis related genes were detected.To consolidate the observation,EBERs-deleted EBV expression plasmid was contructed based on bacterial artificial chromosome(BAC)system.Then expression changes of metastasis related genes were compared between the cells harboring EBV with or without EBERs.Futhermore,the involvement of EMT associated genes in EBERs-mediated metastasis was explored via Western blot,and immunofluorescence was used to detect ZO-1 expression.Results Transient transfetion of EBERs significantly improved metastasis of NPC cells and expression of metastasis related genes.However,EBERs had no impact on NPC cell proliferation.In support of the observation,siRNA targeting EBERs or EBERs deletion significantly decreased expression of metastasis related genes.Furthermore,EBERs expression decreased ZO-1 and E-cadherin expressions while increased Vimentin expression.Conclusions EBERs could promote metastasis of NPC cells,and EMT probably contributes to this process.

EBERs;nasopharyngeal carcinoma;metastasis;EMT

R739.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.005

1005-8982（2016）23-0021-06

2016-08-30

李智，E-mail：peries@163.com；Tel：15802654231