鄒桂欣，尤獻民，趙金明，王光函，李國信

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

論著

白射干素對感染后咳嗽豚鼠細(xì)胞因子的影響

鄒桂欣，尤獻民，趙金明，王光函，李國信

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

目的觀察白射干素對感染后咳嗽（PIC）豚鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的影響。方法復(fù)制PIC豚鼠模型并收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），測定BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細(xì)胞因子白介素-4（IL-4）和干擾素-γ（IFN-γ）水平。結(jié)果模型組豚鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)及IL-4水平較空白組升高（P＜0.05）；IFN-γ水平較空白組降低（P＜0.05）。白射干素干預(yù)組可明顯降低PIC豚鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及IL-4水平，同時升高IFN-γ水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論提示白射干素可能通過調(diào)控細(xì)胞因子而減少模型豚鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤，發(fā)揮其抗炎、止咳作用。

感染后咳嗽；射干；白射干素；白介素-4；干擾素-γ

感染后咳嗽（post-infectious cough，PIC）又稱感冒后咳嗽[1]。目前認(rèn)為呼吸道病毒及其他病原體，如細(xì)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、百日咳桿菌等均可能引起感染后咳嗽，當(dāng)同時存在≥2種病原體感染時，更易使咳嗽延遲不愈[2]。感冒后咳嗽的致病機制可能與氣道炎癥及上皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。細(xì)菌感染是引發(fā)氣道炎癥的重要因素，革蘭陰性菌是呼吸道感染中主要的致病菌之一，而脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是決定革蘭陰性菌致病力的關(guān)鍵毒素[3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者多采用氣道內(nèi)注射LPS法，復(fù)制動物氣道炎癥模型[4-6]。細(xì)胞因子在氣道炎癥發(fā)揮重要作用，其中白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）為Th2型細(xì)胞因子，是一種重要的炎癥表達(dá)因子，干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）為Th1型細(xì)胞因子，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽，能調(diào)節(jié)機體的細(xì)胞免疫功能[7]，IL-4、IFN-γ以相互拮抗的方式，調(diào)節(jié)免疫球蛋白E（immunoglobulins E，IgE）的生成和分泌[8]。調(diào)整Thl/Th2平衡（增強Thl或抑制Th2活性），可能有助于氣道炎癥的治療。

射干（rhizoma belamcandae）作為治療喉痹咽痛的重要藥物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱解毒、消痰、利咽的功效。前期研究結(jié)果提示，射干含有異黃酮成分，有抗炎、止咳等藥理活性作用[9-12]。射干藥材中所含白射干素是其抗炎、止咳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分，因此本實驗采用LPS滴鼻法，復(fù)制動物慢性支氣管炎豚鼠模型，觀察白射干素對模型豚鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchio-loalveolar lavage fluids，BALF）中細(xì)胞因子的影響，以進一步探討其抗炎、止咳的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物豚鼠，雌性，體重300～450 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2010-0001。

1.1.2 主要試劑與儀器白射干素（成都普瑞法科技有限公司，高效液相色譜法測定純度＞98.5%）；肺寧片（批號：140202，吉林吉春制藥股份有限公司），枸櫞酸（批號：20140415，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。IL-4、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。噴霧儀（EM99-002醫(yī)用空壓機，斯萊達(dá)醫(yī)療用品有限公司），日本Sysmex公司全自動模塊式血液體液分析（XN-1000），熏煙箱（自制），黃山牌香煙（焦油含量：11 mg，煙堿含量：1.2 mg，安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型復(fù)制豚鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（20±2）℃，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成6組，即空白組、模型組、白射干素低、中、高劑量組和陽性對照組（肺寧片），每組10只。首先迫使豚鼠慢性吸入香煙煙霧造成氣道高反應(yīng)，用小劑量LPS滴鼻誘導(dǎo)豚鼠氣道炎癥，用枸櫞酸刺激法復(fù)制豚鼠咳嗽模型。具體操作如下：將豚鼠置熏煙箱中，以鋸末20 g+10支香煙點燃煙熏，30 min/次，1次/d，連續(xù)10d，自由進食吸水，于11、14和17 d用乙醚淺麻醉，鼻腔滴入LPS溶液，滴入量以1μl/g計算。于第12、 15和18天，將各組豚鼠置于透明密閉容器中，噴霧儀以4.5 mol/L枸櫞酸霧化溶液激發(fā)咳嗽，40 s/次，1次/d。

1.2.2 給藥方法于第19天開始灌胃，空白組、模型組生理鹽水溶液灌胃20 ml/kg，白射干素高劑量組給藥量為100 mg/（kg·d）[5.00 mg/（ml·d）]，白射干素中劑量組給藥量為50 mg/（kg·d）[2.50 mg/（ml·d）]，白射干素低劑量組給藥量為25 mg/（kg·d）[1.25 mg/（ml·d）]，肺寧片組每天給藥量為580 mg/（kg·d）[29.0 mg/（ml·d）]，灌胃1次/d，連續(xù)給藥5 d，給藥結(jié)束后測定豚鼠各觀察指標(biāo)。

1.2.3 BALF收集分析將實驗豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg/kg）麻醉后仰臥固定于操作臺，打開胸腔，暴露氣管和雙肺，結(jié)扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水2 ml，停留30 s，回吸液體，重復(fù)3次，灌洗液回收率為70%～85%，用2層無菌紗布過濾，取灌洗液在1 200 r/min低溫離心10 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解細(xì)胞沉淀，在全自動模塊式血液體液分析儀上測定白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)，上清液置入-20℃冰箱保存，應(yīng)用IL-4、IFN-γ檢測試劑盒，按試劑盒說明書用ELISA分別測定各檢測指標(biāo)的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用格拉布斯準(zhǔn)則剔除逸出值后，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)測定

2.1.1 白細(xì)胞總數(shù)的變化空白組、模型組、白射干素中、高劑量組及陽性對照組的白細(xì)胞總數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.231，P=0.000）。兩兩比較結(jié)果，模型組與空白組的白細(xì)胞總數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.074，P=0.000），模型組的白細(xì)胞總數(shù)升高；白射干素中、高劑量組與模型組的白細(xì)胞總數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計意義（t=2.675和2.713，P=0.010和0.009），白射干素中、高劑量組的白細(xì)胞總數(shù)降低。

2.1.2 淋巴細(xì)胞計數(shù)的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.846，P= 0.000）。兩兩比較結(jié)果，模型組與空白組的淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 5.445，P=0.000），模型組的淋巴細(xì)胞計數(shù)升高；白射干素中、高劑量組與模型組的淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計意義（t=2.674和3.178，P= 0.01和0.002），白射干素中、高劑量組的淋巴細(xì)胞計數(shù)降低。

2.1.3 中性粒細(xì)胞計數(shù)的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的中性粒細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.990，P=0.000）。兩兩比較結(jié)果，模型組與空白組的中性粒細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.024，P=0.000），模型組的中性粒細(xì)胞計數(shù)升高；白射干素中、高劑量組與模型組的中性粒細(xì)胞計數(shù)比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計意義（t=2.438和2.464，P=0.018和0.017），白射干素中、高劑量組的中性粒細(xì)胞計數(shù)降低，提示白射干素組有減少感染后咳嗽模型豚鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的作用。見表1。

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)比較（n=10，×108/L±s）

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)比較（n=10，×108/L±s）

注：1）與空白組比較，P=0.000；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與模型組比較，P＜0.05

組別白細(xì)胞總數(shù)淋巴細(xì)胞中性粒細(xì)胞空白組0.74±0.070.22±0.110.28±0.08模型組5.45±0.921）0.50±0.081）4.40±0.231）白射干素低劑量組4.50±1.240.44±0.093.52±0.82白射干素中劑量組4.21±1.652）0.38±0.152）3.35±1.333）白射干素高劑量組3.85±1.702）0.36±0.082）3.09±1.753）陽性對照組3.98±1.710.35±0.173.12±1.63 F值15.2316.84614.990 P值0.0000.0000.000

2.2 BALF中IL-4、IFN-γ水平

2.2.1 IL-4表達(dá)的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的IL-4含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.804，P=0.005）。兩兩比較結(jié)果，模型組與空白組的IL-4含量比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.731，P=0.009），模型組的IL-4含量升高；白射干素高劑量組、陽性對照組與模型組的IL-4含量比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計意義（t=2.300和3.702，P=0.026和0.001），白射干素高劑量組、陽性對照組的IL-4含量降低。

2.2.2 IFN-γ表達(dá)的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的IFN-γ含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.738，P= 0.028）。兩兩比較結(jié)果，模型組與空白組的IFN-γ含量比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.151，P=0.003），模型組的IFN-γ含量降低；白射干素中劑量組、陽性對照組與模型組的IFN-γ含量比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計意義（t=-2.405和-3.166，P=0.020和0.003），白射干素中劑量組、陽性對照組的IFN-γ含量升高。提示白射干組有明顯降低感染后咳嗽模型豚鼠BALF中IL-4濃度，升高IFN-γ水平的作用。見表2。

表2 各組BALF中IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，pg/ml±s）

表2 各組BALF中IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，pg/ml±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別IL-4IFN-γ空白組77.12±9.6587.91±13.73模型組89.47±12.851）70.87±7.121）白射干素低劑量組83.11±10.0781.31±12.05白射干素中劑量組78.08±9.4084.28±10.262）白射干素高劑量組80.34±9.052）79.40±12.83陽性對照組73.97±9.213）84.14±13.633）F值3.8042.738 P值0.0050.028

3 討論

感染后咳嗽是一種較常見的呼吸道疾病之一，當(dāng)病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體或其他病原體感染后，呼吸道急性期癥狀消失，而咳嗽仍然遷延不愈，通常持續(xù)3～8周，胸片表現(xiàn)正常，常常能夠自愈，臨床上稱之為感冒后咳嗽。美國胸內(nèi)科醫(yī)師學(xué)會公布《美國肺科醫(yī)師協(xié)會以循證為依據(jù)的感染后咳嗽的臨床實踐指南》，其中指出感染后咳嗽的致病機制可能與呼吸道廣泛的炎癥及上皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。國內(nèi)大多認(rèn)為，氣道炎癥是氣道高反應(yīng)引起咳嗽的決定性因素之一。病原體感染機體后，可使機體的免疫功能紊亂，細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及炎癥細(xì)胞分泌或功能失調(diào)，引起炎癥網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致氣道阻塞性改變、反應(yīng)性增高病理過程的發(fā)生。參與形成氣道炎癥反應(yīng)的免疫因素涉及細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、炎癥細(xì)胞3類物質(zhì)，細(xì)胞因子如白介素，腫瘤壞死因子，轉(zhuǎn)化生長因子等；炎性介質(zhì)主要有白三烯、組胺等；炎癥細(xì)胞包括肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等[13]。T細(xì)胞活化后釋放生物活性物質(zhì)，可引起不同程度的氣道上皮損傷和脫落，激發(fā)氣道炎癥，提高氣道反應(yīng)性，刺激咳嗽發(fā)生，其主要分為Thl和Th2兩類，經(jīng)典的Thl型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子α和白介素-2，Th2細(xì)胞主要分泌的IL-4、白介素-5、白介素-13等細(xì)胞，可輔助B細(xì)胞促進IgE生成、嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophil，EOS）等炎癥細(xì)胞分化、募集、活化和黏液的高分泌，可介導(dǎo)包括支氣管哮喘在內(nèi)的過敏性疾病的發(fā)生、發(fā)展。CD4+T細(xì)胞分泌的Th2細(xì)胞因子與哮喘氣道高反應(yīng)性（airway hyper-reponsiveness，AHR）、氣道EOS浸潤和活化，以及血清IgE增高顯著相關(guān)[14]。Th1對Th2效應(yīng)有拮抗作用。Thl/Th2功能失衡在氣道炎癥中的作用近年來備受關(guān)注，Thl/Th2失衡是氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞處于相對平衡，維持機體正常免疫功能。當(dāng)機體受到抗原刺激時，上述平衡被打破，Th1反應(yīng)降低，Th2反應(yīng)相應(yīng)增加，即趨向于Th2優(yōu)勢，使Th1/Th2失衡導(dǎo)致免疫反應(yīng)性疾病的發(fā)生。而由Th1和Th2細(xì)胞分泌的兩種細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4被認(rèn)為在該病理過程中起關(guān)鍵作用[15]。Thl活性增強或Th2活性被抑制，均有可能改善氣道炎癥癥狀。

白射干素是射干止咳的藥效物質(zhì)成分之一，對由枸櫞酸引咳的雌性豚鼠有一定的止咳作用。本實驗結(jié)果表明，白射干素有降低感染后咳嗽豚鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞的作用，能降低模型動物BALF中IL-4的含量，升高IFN-γ的表達(dá)水平，提示白射干素可能通過調(diào)節(jié)豚鼠BALF中Th1/ Th2平衡而發(fā)揮其抗炎、止咳藥理效應(yīng)。

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（童穎丹 編輯）

Influences of dichotomitin on cytokines in guinea pig with post infectious cough

Gui-xin Zou,Xian-min You,Jin-ming Zhao,Guang-han Wang,Guo-xin Li
(Liaoning Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine,Shenyang, Liaoning 110034,China)

Objective To study the effect of dichotomitin on cytokines in post infectious cough(PIC)model of guinea pig.Methods PIC guinea pig model was established,dichotomitin was given at the same time.Total WBC number,lymphocytes and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were detected.The levels of IFN-γ and IL-4 in BALF were detected by ELISA.Results In the mode group,the number of total WBC count,lymphocytes and neutrophils was increased,IL-4 level increased,IFN-γ level decreased(P＜0.05)in the BALF compared to the blank group.In the dichotomitin group,total WBC count,neutrophils,lymphocytes and the IL-4 level were obviously reduced,but IFN-γ level was increased(P＜0.05).Conclusions Dichotomitin might reduce infiltration of airway inflammatory cells of PIC model of guinea pig,and enhance the immunologic function.

post infectious cough;Rhizoma Belamcandae;dichotomitin;interleukin-4;interferon-γ

R259

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.002

1005-8982（2016）23-0006-04

2015-12-21