趙 新，王 永，劉 娜，陳 銳，朱 珠，王 成，蘭青闊

(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(天津)，天津300381)

金針菇中單增李斯特菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立

趙 新，王 永，劉 娜，陳 銳，朱 珠，王 成，蘭青闊

(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(天津)，天津300381)

為建立不同溫度條件下金針菇中單增李斯特菌的生長(zhǎng)模型，將單增李斯特菌接種到金針菇表面，并于不同溫度下貯藏，獲得其在10、l5、20、25和35 ℃下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，選用Baranyi模型進(jìn)行擬合，建立初級(jí)生長(zhǎng)模型，并擬合得到最大比生長(zhǎng)速率。通過(guò)溫度對(duì)初級(jí)模型中最大比生長(zhǎng)速率的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)擬合，分別建立Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type二級(jí)生長(zhǎng)模型，并進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果表明：Arrhenius-type模型呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，且評(píng)價(jià)結(jié)果優(yōu)于其他模型，可作為次級(jí)模型對(duì)不同溫度下金針菇中單增李斯特茵的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

金針菇；單增李斯特菌；生長(zhǎng)模型；預(yù)測(cè)微生物

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是近年來(lái)報(bào)道較多、關(guān)注度較高、危害性較大的食源性病原菌之一。該菌屬人畜共患菌，分布較廣，一旦感染，致死率高達(dá)20%～30%[1]。該菌耐低溫，在4 ℃條件下仍能生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品中危害人類(lèi)健康的食源性病原菌之一[2-3]，連續(xù)10年被美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)作為導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)的6類(lèi)病原微生物監(jiān)測(cè)對(duì)象之一。由金針菇中感染單增李斯特菌而導(dǎo)致的食源性疾病暴發(fā)事件在美國(guó)、韓國(guó)等地屢有報(bào)道，我國(guó)近幾年對(duì)不同地區(qū)各類(lèi)食品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中，金針菇中單增李斯特菌檢出率也逐年升高。單增李斯特菌雖對(duì)熱的抵抗力較弱，但仍需60 ℃、30 min方可滅活[4]，因此，如果消費(fèi)者對(duì)金針菇的食用方式不恰當(dāng)，則存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)是數(shù)量化描述微生物的新興學(xué)科，它可對(duì)食品的貨架期做出合理預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確估算商品的剩余貨架期，從而成為監(jiān)測(cè)儲(chǔ)藏、流通和零售過(guò)程安全性評(píng)估的有效手段[5]。預(yù)測(cè)模型可定量或半定量的描述在特定環(huán)境條件下食源性病原菌的生長(zhǎng)、殘存和死亡動(dòng)態(tài)，由此確保食品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、銷(xiāo)售和貯藏等一系列環(huán)節(jié)的安全和品質(zhì)[6-7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于食品中微生物預(yù)測(cè)模型的報(bào)道，例如營(yíng)養(yǎng)肉湯[8]、豬肉[9]、洋白菜[10]和萵苣[1]中單增李斯特菌的生長(zhǎng)模型，牛肉和豬肉[11]中大腸桿菌的生長(zhǎng)模型，在冷鮮豬排骨[5]中假單胞菌的生長(zhǎng)模型及冷卻豬肉中的氣單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型[12]等，但研究范圍局限，至今仍處于發(fā)展的初級(jí)階段。IPMP(Intergrated Precffctive Modeling Program)是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部微生物食品安全研究機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)的開(kāi)放性工具軟件，包括11種微生物的35種模型，能夠針對(duì)致病菌的生長(zhǎng)或失活進(jìn)行預(yù)測(cè)；同時(shí)ComBase數(shù)據(jù)庫(kù)也是一個(gè)很好的開(kāi)放性網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，由成千上萬(wàn)的微生物生長(zhǎng)和存活率曲線(xiàn)組成，提供了19種食品、29種微生物和5種環(huán)境因素的模型選擇[13]，都可以很好地彌補(bǔ)研究人員在數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的不足，為預(yù)測(cè)微生物學(xué)的發(fā)展和深入研究提供了很好的輔助工具。

為了能夠?qū)⒁阎L(fēng)險(xiǎn)降低在可控范圍內(nèi)，本研究擬建立單增李斯特菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，通過(guò)IPMP軟件，對(duì)不同溫度下該菌在金針菇中的生長(zhǎng)、殘存和死亡情況進(jìn)行擬合，旨在較為科學(xué)地預(yù)測(cè)該菌在金針菇中的存活情況，為金針菇的安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

金針菇購(gòu)于天津市華苑附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，紫外線(xiàn)下滅菌30 min后，無(wú)菌分裝10 g每份于無(wú)菌袋中，置于冰箱中備用，同時(shí)進(jìn)行本底檢測(cè)。單核增生李斯特氏菌CMCC(B)54002，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基與儀器設(shè)備

PALCAM顆粒型瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、緩沖蛋白胨水(BPW)培養(yǎng)基和生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；法國(guó)科瑪嘉李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基，鄭州博賽生物科技有限公司。

拍擊式均質(zhì)器，上海之信儀器有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本三洋有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；OLYMPUS CX31型顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 金針菇樣品本底檢測(cè)

將紫外線(xiàn)下滅菌30 min的10 g金針菇樣品加入90 mL緩沖蛋白胨水中，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min，取0.1 mL涂布于PALCAM瓊脂平板表面，36 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行本底檢測(cè)，本底帶菌量不得大于103CFU/mL。

1.3.2 接種液的制備

取單增李斯特菌保藏磁珠進(jìn)行菌株活化，對(duì)活化后的菌液進(jìn)行PALCAM平板計(jì)數(shù)，得到活化后密度為104CFU/mL的單增李斯特菌菌液，備用。

1.3.3 金針菇樣品模擬添加試驗(yàn)

將1 mL密度為104CFU/mL的單增李斯特菌菌液接種至10 g經(jīng)紫外線(xiàn)下滅菌的金針菇中，盡量使其均勻飽和吸收，將初始感染濃度為103CFU/g的金針菇樣品，模擬不同溫度(10、15、20、25和35 ℃)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間，取出樣品，放入90 mL緩沖蛋白胨水中，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min，用移液器取0.1 mL稀釋液涂布于PALCAM瓊脂平板，于36 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.4 初級(jí)預(yù)測(cè)模型的建立

應(yīng)用USDA Integrated Predictive Modeling Program (IPMP)工具中Full Growth Models中的Huang模型、Baranyi模型、Gompertz模型分別對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的擬合，建立初級(jí)模型，獲得最大比生長(zhǎng)速率。對(duì)不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較，確定最適初級(jí)預(yù)測(cè)模型。Baranyi Model的表達(dá)式為

Y(t)=Y0+μmaxA(t)-

(1)

exp(-h0)-exp(-μmaxt-h0)]

(2)

式中：t為時(shí)間，h；Y(t)為t時(shí)的菌數(shù)，CFU/g；Y0為初始菌數(shù)，CFU/g；Ymax為最大菌數(shù)，CFU/g；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；h0為模型的參數(shù)。

1.3.5 二級(jí)模型的建立與評(píng)價(jià)

應(yīng)用IPMP工具中Secondary models-Temperature effect中的Ratkowsky(3)、Huang rate(4)、Cardinal(5)和Arrhenius-type(6)這4個(gè)模型，擬合金針菇中單增李斯特菌最大比生長(zhǎng)速率與溫度的函數(shù)關(guān)系，建立二級(jí)模型，并通過(guò)誤差平方和(SSE)，均方誤差(MSE)，均方根誤差/標(biāo)準(zhǔn)誤差(RMSE)，殘留標(biāo)準(zhǔn)偏差Residual stdev等模型參數(shù)進(jìn)行擬合度的比較，對(duì)所建立模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。模型表達(dá)式如下

(3)

(4)

μmax=

(5)

(6)

式中：μ為比生長(zhǎng)速率，h-1；T為特定生長(zhǎng)溫度，℃；T0為最低生長(zhǎng)溫度，℃；Tmin為最低生長(zhǎng)溫度，℃；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Tmin和Tmax分別為最低生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度，℃；μopt為最適溫度Topt下的生長(zhǎng)速率，lg(CFU/g)；R為氣體常數(shù)(8.134 J/mol)；△G′為與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)的一種動(dòng)能；a和n為模型的參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 初級(jí)預(yù)測(cè)模型的建立

根據(jù)10、15、20、25和35 ℃下單增李斯特菌在金針菇中生長(zhǎng)試驗(yàn)的觀察值，選用Huang模型、Baranyi模型、Gompertz模型分別描述單增李斯特菌在金針菇中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。通過(guò)不同模型SSE、MSE、RMSE和AIC等相關(guān)參數(shù)的比較，結(jié)果如表1所示。由表1可以確定最適初級(jí)預(yù)測(cè)模型為Baranyi模型。

表1 不同模型相關(guān)參數(shù)的比較Table 1 Comparison of different model parameters

SSE、MSE、RMSE和AIC是對(duì)方程的錯(cuò)誤分析，參數(shù)值越小表明方程描述單增李斯特菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)誤差越小。AIC代表Akaike準(zhǔn)則。通過(guò)分析最終確定以Baranyi模型作為單增李斯特菌在金針菇中生長(zhǎng)的初級(jí)預(yù)測(cè)模型。金針菇中單增李斯特菌的初始帶菌量為103CFU/mL。將10、15、20、25和35 ℃條件下測(cè)定的金針菇中單增李斯特菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，選用Baranyi模型進(jìn)行擬合，所得的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示。

由圖1可知：在10 ℃時(shí)，單增李斯特菌的生長(zhǎng)比較緩慢，延至期時(shí)間較長(zhǎng)；隨著溫度的升高，單增李斯特菌的生長(zhǎng)逐漸加快，延至期時(shí)間明顯縮短，最大比生長(zhǎng)速率逐漸增加，具體數(shù)值見(jiàn)表2。

2.2 二級(jí)模型的建立與評(píng)價(jià)

應(yīng)用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type這4個(gè)模型，將表2中得到的最大比生長(zhǎng)速率與溫度這一環(huán)境條件進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。由圖2和表3可知，在對(duì)最大比生長(zhǎng)速率的擬合方面，Arrhenius-type模型的SSE、MSE、RMSE和Residual stdev(殘留標(biāo)準(zhǔn)偏差)均為4個(gè)模型中最小參數(shù)值，參數(shù)值越小表明方程描述單增李斯特菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)誤差越小，方程的擬合度越好。

Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型和Arrhenius-type模型的預(yù)測(cè)值和Baranyi模型的觀測(cè)值見(jiàn)表4，預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值之間的擬合程度分別用A、B、C和D表示(A、B、C和D分別表示二者差異絕對(duì)值由小到大)。由表4可知：除10和35 ℃外，Arrhenius-type模型對(duì)單增李斯特菌在金針菇中的擬合效果最佳，預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間存在的差異均為最小，標(biāo)記為A。在10 ℃條件下，Cardinal和Huang rate模型的擬合效果較好，Arrhenius-type模型擬合度絕對(duì)值偏差次之，標(biāo)記為B；在35 ℃條件下，Cardinal模型的擬合效果較好，Arrhenius-type模型擬合度絕對(duì)值偏差次之，標(biāo)記為C，但綜合所有溫度數(shù)據(jù)顯示，依然是Arrhenius-type模型的擬合效果最佳，因此確定Arrhenius-type模型為單增李斯特菌在金針菇中的二級(jí)生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。

圖1 Baranyi模型擬合的不同溫度條件下測(cè)定的金針菇中單增李斯特菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)Fig.1 Growth data of L. monocytogenes in needle mushroom fitted of Baranyi model at different temperatures表2 不同溫度下單增李斯特菌的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期Table 2 Maximum growth rate and lag ofL. monocytogenes at different temperatures

溫度/℃最大比生長(zhǎng)速率/h-1生長(zhǎng)延滯期/h100033383911500814304200222352825032336013504142461

圖2 不同溫度條件下單增李斯特菌的最大比生長(zhǎng)速率擬合的模型Fig.2 Maximum specific growth rate fitting model at different temperature conditions of L.monocytogenes表3 不同模型相關(guān)參數(shù)的比較Table 3 The comparison of different model parameters

模型SSEMSERMSEResidualstdevRatkowsky0005000200390030Huangrate0004000100370028Cardinal0001000100240011Arrhenius?type0001000000170010

圖3反映了二級(jí)模型的預(yù)測(cè)值與觀察值之間的顯著性差異。由圖3可知：Arrhenius-type模型擬合的預(yù)測(cè)值與Baranyi模型得到的觀測(cè)值擬合程度最為接近，表明Arrhenius-type模型可很好的描述單增李斯特菌在金針菇中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為最佳次級(jí)模型。

二級(jí)模型建立后，對(duì)其可靠性進(jìn)行分析是模型建立過(guò)程中重要環(huán)節(jié)之一，目前常用的方法有參數(shù)誤差分析和圖像分析。參數(shù)誤差分析是通過(guò)擬合軟件中生成的相關(guān)參數(shù)誤差數(shù)據(jù)，進(jìn)行羅列和比較，參數(shù)誤差值越小表明模型的擬合效果越好。圖像分析[14]是通過(guò)用圖表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值散點(diǎn)之間的擬合度絕對(duì)值偏差，偏差越小表明擬合程度越好。通過(guò)Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型、Arrhenius-type模型的預(yù)測(cè)值和Baranyi模型的觀測(cè)值之間的擬合度絕對(duì)值偏差分析，Arrhenius-type模型的預(yù)測(cè)值除10 ℃外幾乎全部與Baranyi模型觀測(cè)值散點(diǎn)重合，體現(xiàn)了Arrhenius-type模型的預(yù)測(cè)值能夠很好地吻合觀測(cè)值。

綜合圖3結(jié)果及SSE、MSE、RMSE和Residual stdev等相關(guān)參數(shù)的誤差分析，可以直觀地評(píng)價(jià)Arrhenius-type模型的擬合效果較好，說(shuō)明所建立的模型能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)單增李斯特菌在金針菇中的生長(zhǎng)狀況。

表4 不同溫度條件下單增李斯特菌的觀測(cè)值和預(yù)測(cè)值Table 4 Observed and predicted values of L.monocytogenes at different temperatures conditions

注：不同的大寫(xiě)字母表示預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值之間存在的差異絕對(duì)值。

圖3 二級(jí)模型的預(yù)測(cè)值與觀察值之間的顯著性差異Fig.3 Significantly differents of observed valuesand predicted values of secondary model

3 結(jié)論

金針菇作為中國(guó)居民較為喜愛(ài)的食品之一，在國(guó)內(nèi)研究還相對(duì)較少，為探討單增李斯特菌在金針菇生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中的消長(zhǎng)規(guī)律，通過(guò)IPMP開(kāi)放軟件，對(duì)不同溫度下單增李斯特菌在金針菇中的生長(zhǎng)、殘存和死亡情況進(jìn)行擬合。首先確定最適初級(jí)預(yù)測(cè)模型為Baranyi模型，然后應(yīng)用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal和Arrhenius-type這4個(gè)模型，通過(guò)溫度對(duì)初級(jí)模型中最大比生長(zhǎng)速率的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)擬合，確定Arrhenius-type模型為單增李斯特菌在金針菇中的二級(jí)生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，該模型能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)單增李斯特菌在金針菇中的生長(zhǎng)狀況。本研究對(duì)單增李斯特菌的存活情況做出較為科學(xué)的預(yù)測(cè)，為監(jiān)控金針菇的食品安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 張引成，尹曉婷，雷云，等.鮮切結(jié)球萵苣中單增李斯特菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(7):30-34.

[2] 丁甜，董慶利，王璐，等.單增李斯特菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中最大比生長(zhǎng)速率的預(yù)測(cè)模型[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29(4):522-526.

[3] 鄭麗敏,董慶利,丁甜,等.即食涼拌菜中單增李斯特菌生長(zhǎng)模型的建立[J].食品科學(xué),2013,34(15):22-26.

[4] 鄭麗敏.即食涼拌菜中單增李斯特菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與管理[D].上海：上海理工大學(xué),2012.

[5] 熊丹萍,劉超群,王宏勛.冷鮮豬排骨假單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證[J].中國(guó)釀造,2013,32(2):33-36.

[6] NAKAMA A,MATSUDA M,ITOH T,et al.Molecular typing ofListeriamonocytogenesisolated in Japan by pulsed-field gel electrophoresis[J].J Vet Medi Sci,1998,60(6):749-752.

[7] MCDONALD K,SUN D W.Predictive food microbiology for the meat industry:a review[J].Int J Food Microbiol,1999,52(1):1-27.

[8] JIN S S,KHEN B K,YOON K S,et al.Effects of temperature,pH,and potassium lactate on growth ofListeriamonocytogenesin broth[J].Food Sci Biotechnol,2005,14(6):847-853.

[9] KOSEKI S,ITOH K.Prediction of microbial growth in fresh-cut vegetables treated with acidic electrolyzed water during storage under various temperature conditions[J].J Food Prot,2001,64(12):1935-1942.

[10] GILL C O,GREER G G,DILTS B D.The aerobic growth ofAeromonashydrophilaandListeriamonocytogenesin broths and on pork[J].Int J Food Microbiol,1997,35(1):67-74.

[11] DING T,RAHMAN S M E,PUREV U,et al.Modelling ofEscherichiacoliO157:H7 growth at various storage temperatures on beef treated with electrolyzed oxidizing water[J].J Food Eng,2010,97(4):497-503.

[12] 董慶利,高翠,丁甜,等.冷卻豬肉中氣單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立和檢驗(yàn)[J].生物加工過(guò)程,2012,10(2):50-54.

[13] 周康,劉壽春,李平蘭,等.食品微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究新進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(4):589-594.

[14] BANG W S,CHUNG H J,JIN S S,et al.Prediction ofListeriamonocytogenesgrowth kinetics in sausages formulated with antimicrobials as a function of temperature and concentrations[J].Food Sci Biotechnol,2008,17(6):1316-1321.

(責(zé)任編輯 管珺)

Establishment of Listeria monocytogenes growth predictive modelesin edible mushroom Flammulina velutipes

ZHAO Xin,WANG Yong,LIU Na,CHEN Rui,ZHU Zhu,WANG Cheng,LAN Qingkuo

(Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products (Tianjin) of the Ministry of Agriculture,Tianjin Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology,Tianjin 300381,China)

We established a growth model ofListeriamonocytogenesin edible mushroomFlammulinavelutipesat different temperature.Listeriamonocytogeneswas inoculated to the mushroom to obtain growth data at 10,15,20,25 and 35 ℃.Baranyi model was fitted with the primary growth model to get the maximum specific growth rate.By fitting temperature to the maximum specific growth rate kinetics in the primary model,we established Ratkowsky,Huang rate,Cardinal and Arrhenius-type model.The Arrhenius-type model can be used as a secondary model at different temperatures for the growth ofListeriamonocytogenesin the mushroom，with a good linear relationship,and the prediction results were better than the other models.

needle mushroom;Listeriamonocytogenes; growth model; predictive microbiology

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.003

2016-03-01

2016年國(guó)家食用菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP201600602)；2016年國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品病原微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP201601302)

趙 新(1983—)，女，北京人，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品病原微生物分子檢測(cè)技術(shù)；蘭青闊(聯(lián)系人)，副研究員，E-mail：lanqingkuo@126.com

TS251.5

A

1672-3678(2016)06-0012-06