岳 苑

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏銀川750001)

實時熒光PCR法檢測肉制品中雞、鴨源性成分

岳 苑

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏銀川750001)

根據(jù)雞、鴨線粒體DNA(mtDNA)序列設(shè)計了雞、鴨特異性引物及Taqman探針，建立了肉制品中雞、鴨源性成分的實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)?real-time PCR)檢測方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用此方法，兩種動物源性的最低檢出限值(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.01%和0.001%。實時熒光PCR法能夠作為肉制品中檢測雞、鴨源性成分的有效方法。

實時熒光PCR；雞源性；鴨源性；肉制品

寧夏因為得天獨厚的地理位置，為種養(yǎng)殖業(yè)提供了獨一無二的優(yōu)質(zhì)氣候、飼料及水源，使得寧夏的牛羊肉具有肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富和口感鮮美的特點，已成為寧夏的特色優(yōu)勢產(chǎn)品。隨著中阿論壇會址永久落戶寧夏，為寧夏的牛羊肉制品享譽全國、走向世界創(chuàng)造了無與倫比的條件，牛羊肉產(chǎn)業(yè)已逐漸成為寧夏著力培育、發(fā)展的六大戰(zhàn)略性支柱產(chǎn)業(yè)之一。

近幾年，一些商販為謀求高額利潤，將劣質(zhì)鴨肉摻入牛羊肉制品中銷售，擾亂了牛羊肉制品銷售市場的秩序，損害了寧夏牛羊肉品牌的聲譽，同時也帶來了食品安全隱患問題。但由于沒有針對性強的檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)，因此無法解決這一問題，導(dǎo)致其摻假現(xiàn)象不能得到有效遏制。

目前，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測技術(shù)已是食品中肉類成分鑒別的主流技術(shù)[1]。國外學(xué)者報道了豬、牛、羊、雞、火雞、野鴨、鵝、馬和驢源性成分的常規(guī)PCR[2-5]和熒光定量PCR[6-12]的檢測方法。國內(nèi)已有關(guān)于豬[12]、牛[13]、羊[13-15]、兔[16]、馬[15-16]、驢[16]和魚[17]動物源性成分分析的報道，但用實時熒光PCR技術(shù)檢測雞、鴨源性成分的方法還不多見。本試驗根據(jù)GenBank中雞和鴨線粒體DNA設(shè)計特異性引物和Taqman探針，以期建立肉制品中雞、鴨源性成分的熒光PCR檢測方法，為杜絕食品行業(yè)中的肉制品摻假行為提供快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 肉制品

豬肉、牛肉、羊肉、魚肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、驢肉、馬肉、狗肉等動物生肉為銀川市售產(chǎn)品。

1.2 試劑和儀器

動物源性基因組DNA提取試劑盒和Premix Ex TaqTM,TaKaRa公司;實時熒光定量PCR儀,Eppendorf公司;核酸分析儀,Thermo公司;高速冷凍離心機,Hitachi公司。

1.3 模板制備

采用TaKaRa公司基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取各物種基因組DNA作為模板或陰性對照，無菌超純水作為空白對照。稱10 mg左右樣品加入DNA提取試劑盒中，充分剪碎，70～100 ℃加熱10 min。在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min后，吸上清液100 μL于新的離心管中備用。

1.4 引物、探針設(shè)計與合成

選擇雞、鴨線粒體DNA設(shè)計雞和鴨的特異性引物和TaqMan探針，擴增片段分別為111和90 bp，引物序列見表1。引物和探針均由TaKaRa公司合成。

1.5 實時熒光PCR檢測

熒光PCR反應(yīng)體系為25 μL，各組分含量分別為PCR Mix10.0 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，5 μmol/L探針1 μL，模板DNA(50～100 ng)1 μL，無菌超純水將體系補充至25 μL，混勻后離心。雞、鴨源性成分?jǐn)U增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性5 s、60 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。

1.6 特異性試驗

取市場購買的豬肉、牛肉、羊肉和魚肉等10種肉作為模板加入反應(yīng)體系中進行擴增。

表1 PCR引物、TaqMan探針序列Table 1 Sequences of PCR primers and TaqMan probes

1.7 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗

用雞肉和鴨肉提取的DNA為模板，按照前述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件分別進行PCR擴增，同一模板重復(fù)15次，研究所建立體系的穩(wěn)定性。

1.8 靈敏度試驗

將雞肉、鴨肉和羊肉切成薄片分別置于90 ℃的烘箱中烘烤24 h，然后將各材料分別研磨成細(xì)粉。向羊肉粉中分別加入雞肉粉和鴨肉粉，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到0.01%、0.1%和1%，充分混勻，模擬真實的羊肉摻假情況。提取以上DNA作為模版，進行PCR反應(yīng)。確定檢出限含量后重復(fù)8次試驗來確定檢出限是否穩(wěn)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞、鴨源性成分特異性試驗

用設(shè)計的雞、鴨源性引物和TaqMan探針分別對所提取的雞、鴨DNA進行PCR擴增，部分結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：提取的雞、鴨DNA擴增后均能得到典型的擴增曲線，而豬、牛、羊和魚等9種DNA樣品未呈現(xiàn)S型擴增曲線，說明本方法設(shè)計的雞、鴨源性引物和TaqMan探針具有良好的特異性。

2.2 PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

用提取的雞肉、鴨肉DNA為模板進行實時熒光PCR反應(yīng)，同一模板重復(fù)15次，考察雞、鴨源性成分Ct值(每個反應(yīng)管的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，結(jié)果見表2。由表2可知：雞、鴨源性成分Ct值的平均值分別為16.54、16.16，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19、0.25，變異系數(shù)為1.15%、1.55%，這說明本方法所建立的體系較為穩(wěn)定。

圖1 雞、鴨源性成分實時熒光PCR特異性試驗Fig.1 Real-time PCR specificity test of chicken and duck ingredients表2 雞、鴨源性成分實時熒光PCR方法重復(fù)試驗結(jié)果Table 2 Real-time PCR repeat test results of chicken and duck ingredients

動物源性Ct123456789101112131415平均值(Ct)標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)/%雞1686165816811659166163164116691661649162316221646166016631654019115鴨160316091596156516116151666161716171632164116121639163815871616025155

2.3 PCR反應(yīng)靈敏度試驗結(jié)果

向制備好的羊肉粉中分別混入不同含量的雞肉粉和鴨肉粉，提取DNA作為模板進行PCR擴增，結(jié)果分別見圖2和圖3。由圖2和圖3可知：當(dāng)雞肉粉稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%、鴨肉粉稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%時，能夠呈現(xiàn)S型擴增曲線，擴增結(jié)果Ct值均<35.0，平均值分別為30.74和34.43，說明本試驗可以檢測最低含量為0.01%的單一雞源性成分和含量0.001%的單一鴨源性成分。在確定檢出限含量后，重復(fù)試驗8次，結(jié)果見表3。由表3可知，本方法檢出限結(jié)果穩(wěn)定。

圖2 雞源性成分靈敏度試驗Fig.2 Sensitivity test of chicken ingredient

圖3 鴨源性成分靈敏度試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity test of duck ingredient表3 雞、鴨源性成分靈敏度重復(fù)試驗結(jié)果Table 3 Sensitivity test results of chicken and duck ingredients

來源w(DNA)/%次 數(shù)12345678均值雞1 2481248424432469241024422464245324560102759274627602699275426852729269327280013074307430663095306730793061308030740001349335093506351934863512350735953516鴨1 2288230422992298234023172322232923120102659264226432651266926312641264226470013032304029943005301630113000303330160001338833693398348734733492350734293443

3 結(jié)論

本試驗通過尋找雞、鴨線粒體DNA的保守區(qū)域，設(shè)計篩選特異性的引物和Taqman探針進行試驗，對肉制品是否摻假作出判斷。試驗設(shè)計的引物和探針能夠特異性的擴增出雞、鴨源性成分，兩種動物源性的最低檢出限值(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.01%和0.001%。

總之，該方法的特異性好，靈敏度高，簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于肉制品中雞、鴨源性成分檢測，能夠為肉制品的質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)和參考。

[1] 陳穎,吳亞君,徐寶梁,等.食品及飼料中馬屬動物源性成分的PCR檢測研究[J].中國生物工程雜志,2004(5):78-83.

[3] DALMASSO A,FONTANELLA E,PIATTI P,et al.A multiplex PCR assay for the identfication of animal species in feedstuffs[J].Mol Cell Probes,2004,18(2):81-87.

[5] HAUNSHI S,BASUMATARY R,GIRISH P S,et al.Identification of chicken,duck,pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin[J].Meat Sci,2009,83(3):454-459.

[6] DOOLEY J J,PAINE K E,GARRETT S D,et al.Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays[j].Meat Sci,2004,68(3):431-438.

[7] JONKER K M,TILBURG J J H C,BOER G H H E D,et al.Species identification in meat products using real-time PCR[J].Food Addit Contam,2008,25(5):527-533.

[8] KESMEN Z,GULLUCE A,SAHIN F,et al.Identification of meat species by Taq Man-based real-time PCR assay[j].Meat Sci,2009,82(4):444-449.

[9] ZULALK,YETIMAN A E,SAHIN F,et al.Detection of chicken and turkey meat in meat mixtures by using real-time PCR assays[J].J Food Sci,2012,77(2):167-173.

[10] K?PPEL R,ZIMMERLI F,BREITENMOSER A.Heptaplex real-time PCR for the identification and quantification of DNA from beef,pork,chicken,turkey,horse meat,sheep and goat[J].Eur Food Res Technol,2009,230(1):125-133.

[11] SAWYER J,WOOD C,SHANAHAN D,et al.Real-time PCR for quantitative meat species testing[J].Food Control,2003,14(8):579-583.

[12] 王萍,喬勇升,韓芷玲.豬源性成分檢測中3種DNA提取方法比較[J].生物加工過程,2015,13(6):61-64.

[13] 陳茹,林志雄,劉琳琳.應(yīng)用PCR等核酸技術(shù)檢驗動物飼料中牛羊組織成分[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(9):3-8.

[14] 曹際娟,盧行安,秦成,等.實時熒光PCR技術(shù)檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技術(shù)通訊,2002,13(2):158-160.

[15] 馮海永,韓建林.羊肉產(chǎn)品中若干動物源性成分的七重 PCR檢測技術(shù)應(yīng)用研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(9):85-90.

[16] 楊寶華,宗卉.根據(jù)線粒體基因的特異性鑒別檢測飼料中的動物源性成分[J].科學(xué)試驗與研究,2000(5):1-3.

[17] 龐杰,王金玲,張瑩,等.飼料中魚源性成分定量檢測的實時熒光PCR技術(shù)的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2010(5):680-692.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Real-time PCRfor identification of chicken and duck ingredients in meat product

YUE Yuan

(Ningxia Hui Autonomous Region Food Inspection Center,Yinchuan 750001,China)

A real-time PCR assay to detect chicken and duck ingredients in meat product was described.According to chicken and duck mitochondrial DNA sequence,we have designed the species-specific PCR primer and Taqman probe. This method could detect the presence of DNA in food and feedstuffs containing less than 0.01 % (w/w) chicken and 0.001 % (w/w) duck ingredients. It could be an effective method to detect chicken and duck ingredients in meat products.

real-time PCR; chicken ingredient; duck ingredients; meat product

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.008

2016-09-19

岳 苑(1982—)，女，四川蓬溪人，工程師，研究方向：食品微生物檢測，E-mail:yueyuan_0421@126.com

TS207.3

A

1672-3678(2016)06-0041-05