熊 強，王 凱，王延斌

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800)

植物乳桿菌的功能評價

熊 強，王 凱，王延斌

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800)

植物乳桿菌；胞外多糖;抗氧化

益生性乳酸菌可黏附到人體腸道上皮細胞、在黏膜表面定殖，并且能在人的胃腸道存活，調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡。它在人體中起著積極的作用，有降低膽固醇、抗氧化、提高免疫力、優(yōu)化腸道微環(huán)境等生物學(xué)功能[1]。Liu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，L.paracaseispp.paracaseiNTU 101和102 合成的多糖EPSs，對DPPH自由基(·DPPH)的清除能力與陽性對照品Vc相接近，且均表現(xiàn)出溫和的脂質(zhì)過氧化抑制作用和Fe2+螯合能力。乳酸菌產(chǎn)生膽鹽水解酶，催化胃腸道中結(jié)合態(tài)膽鹽水解為氨基酸殘基和游離的膽酸[3]，從而降低血清膽固醇。益生菌還可以通過同化吸收或細胞表面結(jié)合的方式降低膽固醇[4]。目前，國內(nèi)對優(yōu)良的益生性乳酸菌發(fā)酵劑的研發(fā)尚缺乏，因此乳酸菌益生性的研究有待深入，這將有助于提升乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，從而促進我國食品發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展。

本文中，筆者對實驗室篩選得到的乳酸菌株進行耐酸、耐膽鹽和耐人工腸胃液試驗，考察乳酸菌的環(huán)境耐受性；結(jié)合乳酸菌降膽固醇及其胞外多糖抗氧化試驗，考察乳酸菌的益生性。最終篩選出具有環(huán)境耐受性的優(yōu)良益生性乳酸菌，為乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(PYG)[5](1 L)：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，胰酶解酪朊5 g，酵母提取物10 g，鹽溶液40 mL，瓊脂20 g，溴甲基酚紫0.04 g；pH 6.8。

乳酸細菌液體培養(yǎng)基(MRS)[5](1 L)：胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉5 g，檸檬酸鐵銨2 g，乙酸鈉5 g，Na2HPO42 g，MnSO4·H2O 0.05 g,MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖15 g，乳糖5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,吐溫-80 1 mL；pH 6.7。

乳酸細菌降膽固醇培養(yǎng)基(MRS-CHOL-THIO)[6]：MRS液體培養(yǎng)基中加入已過濾除菌的質(zhì)量分數(shù)0.20%的巰基乙酸鈉、3 g/L膽鹽和100 μg/mL膽固醇，加熱溶解。

以上培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌15 min。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

752s型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；SW-CJ-1FD型超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；KH3200型超聲波破碎儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；GL-21M型立式高速冷凍離心機，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；氮吹儀，上海濟成分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌的分離鑒定

從實驗室自制泡菜中，按照初篩、復(fù)篩步驟分離純化乳酸菌[5]。利用過氧化氫酶試驗、H2S試驗、糖發(fā)酵試驗等生理生化試驗及16S rDNA分子鑒定方法[5]，對分離得到的菌株進行鑒定。

1.2.2 環(huán)境耐受性試驗

1)耐酸性試驗

利用乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)，在37 ℃下活化兩代。取2 mL活化好的菌液，分別接種至pH 3.0和pH 6.4的100 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)3 h后取樣進行平板菌落計數(shù)。

2)耐膽鹽試驗

將活化好的菌株以2%接種量(體積分數(shù))接至含30 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h。分別取0和8 h時的菌液進行平板菌落計數(shù)。

3)人工胃液和人工腸液耐受性試驗

以2%接種量將活化好的菌株接種至無菌的pH 3.0的人工胃液[6]中，37 ℃培養(yǎng)，3 h后取樣進行平板菌落計數(shù)。然后，取人工胃液中培養(yǎng)3 h后的菌液，以2%接種量接種至無菌的pH 8.0的人工腸液[6]中，37 ℃培養(yǎng)8 h后測定活菌數(shù)。

4)評價指標

以存活率作為環(huán)境耐受性試驗的評價指標，存活率計算見式(1)。

(1)

式中：N0、Nt分別為在上述試驗條件下，0 h和th后測得的活菌數(shù)。

1.2.3 體外降膽固醇能力的測定

植物乳桿菌降膽固醇能力的測定參照文獻[6]的方法，膽固醇標準曲線見圖1。

圖1 膽固醇標準曲線Fig.1 The standard curve of cholesterol

1.2.4 植物乳桿菌胞外多糖的抗氧化能力測定

1)植物乳桿菌胞外多糖的分離純化

粗多糖分離后[7]，采用DEAE-Sepharose Fast Flow 離子柱和Sepharose CL-6B凝膠柱分步純化，測定收集管中多糖，合并收集峰組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥得到多糖樣品。

2)植物乳桿菌胞外多糖結(jié)構(gòu)的初步鑒定

通過紫外分光光度法測蛋白核酸吸收[8]，傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)分析多糖的結(jié)構(gòu)[9]，凝膠層析分析多糖的相對分子質(zhì)量，HPLC分析多糖的單糖組成[10]。

3)·DPPH清除能力的測定

參照文獻[11]的方法測定植物乳桿菌胞外多糖對·DPPH清除能力。

(2)

式中：A0為等體積甲醇代替·DPPH溶液的吸光值，作空白；An是等體積蒸餾水代替樣品溶液后的吸光值，為對照組；Am為樣品溶液與·DPPH甲醇溶液在室溫下避光反應(yīng)0.5 h后，517 nm處測的吸光值。

4)羥基自由基清除能力的測定

參照文獻[12]的方法測定植物乳桿菌胞外多糖對羥基自由基清除能力。

(3)

注：Ah為用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2后測得的吸光值；Ae為用樣品代替1 mL蒸餾水后的結(jié)果；Ay為鄰二氮菲溶液，F(xiàn)eSO4溶液和H2O2溶液，在37 ℃的水浴中，反應(yīng)1.5 h后，在536 nm處測得的吸光度。

5)超氧陰離子自由基清除能力的測定

(4)

式中:A為在3 mL Tris-HCl緩沖液中加入適量樣品，測樣品的鄰苯三酚自氧化速率，Ao為對照值。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)為3次平行測定值的平均值，數(shù)據(jù)以X±SD表示。顯著性分析采用 SPSS 20.0(SPSS 公司)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA，Student-Newman-Keuls)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌鑒定結(jié)果

篩選得到的6株菌，它們都是革蘭氏陽性菌(G+)、無芽孢桿菌，接觸酶陰性、不產(chǎn)生H2S，結(jié)合糖發(fā)酵試驗的結(jié)果初步鑒定為乳桿菌屬[1]。對菌株Z22進行16S rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立，結(jié)果見圖2和3。由圖3可知，菌株Z22與植物乳桿菌相似度為99%。

M—GeneRuler 1 kb DNA Ladder;1—菌株Z22的16S rDNA PCR結(jié)果圖2 菌株Z22的16S rDNA基因擴增電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR-amplified16S rDNA from Z22

2.2 耐酸及耐胃液試驗結(jié)果

當進食時，通常人胃部的pH維持在3.0左右[13],食物在胃中停留時間較短，一般為1～3 h[14]。因此，選擇在pH 3.0的條件下，檢測供試菌株在酸性培養(yǎng)基和人工胃液培養(yǎng)3 h后的存活率，結(jié)果見圖4。

圖3 基于16S rDNA建立的乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Lactobacillus based on 16S rDNA gene sequence

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)圖4 6株植物乳桿菌分別在pH3.0和人工胃液的條件下培養(yǎng)3 h后的存活率Fig.4 The survival rates of six strains L.plantarum in pH 3.0 and simulated gastric fluidafter three hours

由圖4可知：6株植物乳桿菌在pH 3.0的條件下，培養(yǎng)3 h后，均有很高的存活率，表現(xiàn)出很好的耐酸性。其中，Z12存活率最高，達到98.08%；Z22次之，為96.75%；6株植物乳桿菌在人工胃液中培養(yǎng)3 h后，同樣有較高的存活率，Z22最高，為95.45%；Z31次之，為90.42%，說明這幾株菌都有較好的耐胃蛋白酶和耐酸的能力。

2.3 耐膽鹽及耐腸液試驗結(jié)果

食物在小腸中停留的時間為3～8 h[14]，小腸內(nèi)膽酸鹽濃度通常低于4 g/L[15],一般維持在3 g/L。因此測定3 g/L膽鹽的條件下，8 h后供試菌株的存活率，結(jié)果見圖5。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)圖5 6株植物乳桿菌分別在3 g/L膽鹽和人工腸液的條件下培養(yǎng)8 h后的存活率Fig.5 The survival of six strains L.plantarum in thecondition of 3 g/L bile salt and simulatedintestinal fluid

由圖5可知：所有的供試菌株在3 g/L膽鹽條件下維持8 h后，仍然保持較高的存活率，Z22存活率最高為76.59%；Z12次之，為72.63%。胃液培養(yǎng)4 h后的菌株在人工腸液中繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，存活率明顯下降，Z22存活率最高，僅為45.24%；F21次之，為43.35%。這些結(jié)果表明植物乳桿菌對膽鹽比較敏感，Hamon等[16]對LC56 的研究和Karasu等[17]關(guān)于LP3 的試驗也說明了這一點。同時，胃液環(huán)境對植物乳桿菌生長不利，從而導(dǎo)致了6株菌在腸液中的存活率顯著下降。盡管如此，Z22還是表現(xiàn)出了較好的耐膽鹽和耐腸液的能力。

2.4 降膽固醇試驗結(jié)果

考察6株菌的降膽固醇試驗，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：6株供試菌株均有較好的膽固醇脫除能力，膽固醇脫除率均超過了40%，其中，Z22對膽固醇脫除率最高，達到65.80%；Z31次之，脫除率為55.95%。由于膽固醇的脫除率會隨著膽酸鹽濃度提高而增加[18-19]，同時也與培養(yǎng)基中添加的膽固醇質(zhì)量濃度成正比[20]，因此在不同的條件下，試驗結(jié)果也會不同。但總體而言，菌株Z22和Z31還是表現(xiàn)出較好的膽固醇去除能力。

不同字母表示差異極顯著(P<0.01)圖6 6株植物乳桿菌膽固醇脫除率Fig.6 The cholesterol removal of six strains L. plantarum

2.5 植物乳桿菌胞外多糖結(jié)構(gòu)的初步表征

綜上可以發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌Z22表現(xiàn)出較好的性能，因此,選擇菌株Z22進行胞外多糖的分離純化。通過粗提取和層析柱分離純化，得到不帶電荷的中性多糖EPS-Z(平均相對分子質(zhì)量為2.42×105)和帶負電荷的酸性多糖EPS-S(平均相對分子質(zhì)量為3.20×105)。利用色譜法研究兩種多糖的單糖組成，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 6種單糖標準品的PMP衍生物的液相色譜Fig.7 HPLC chromatogram of PMP derivatives of the six kinds of monosaccharides

圖8 EPS-Z(a)和EPS-S(b)的液相色譜Fig.8 HPLC chromatogram of EPS-Z(a)and EPS-S(b)

由圖7和圖8可知，EPS-Z含Man和Glc，其質(zhì)量比為3.22∶ 1.00，沒有檢測到糖醛酸的存在；EPS-S由Man、Glc、Rham、Gal和Xyl組成，其質(zhì)量比為8.57∶ 6.10∶ 2.42∶ 1.29∶ 1.00，其含GlcUA占單糖總和的7.29%，這正是酸性多糖帶負電荷的原因。

利用紫外分析這兩種胞外多糖，結(jié)果見圖9。由圖9可知：EPS-S和EPS-Z在260～280 nm之間沒有吸收峰，表明多糖組成中不含核酸和蛋白。

圖9 EPS-Z和EPS-S紫外分析譜Fig.9 UV analysis spectra of EPS-Z and EPS-S

利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)來分析這兩種多糖，結(jié)果見圖10。由圖10可以發(fā)現(xiàn)：EPS-Z和EPS-S均為β-型吡喃糖，具有多糖特征吸收峰，具有—OH、—O—、—COO—等官能團。

圖10 植物乳桿菌Z22胞外多糖 EPS-Z和EPS-S紅外光譜圖Fig.10 FT-IR spectra of the extracellular polysaccharideEPS-Z and EPS-S from L. plantarum Z22

2.6 植物乳桿菌多糖胞外抗氧化能力的測定

分別考察植物乳桿菌Z22 EPS-Z和EPS-S對·DPPH、·OH、·O2-基的清除能力，結(jié)果見圖11～13。

圖11 植物乳桿菌Z22胞外多糖對·DPPH的清除能力Fig.11 Scavenging activity of extracellular polysaccharideL. plantarum Z22 on DPPH radical

由圖11可知：以Vc做陽性對照，植物乳桿菌Z22的胞外酸性多糖EPS-S和中性多糖EPS-Z對·DPPH的清除能力隨著多糖濃度的增加而增強，在1 mg/mL時，分別達到27.75%和24.02%。酸性多糖EPS-S的清除效果總體要優(yōu)于EPS-Z，可能是酸性多糖含有糖醛酸，提升了其對·DPPH的清除能力。在多糖中含有的糖醛酸，為其提供大量的負電荷，這些帶負電荷的多糖分子，由于內(nèi)部的排斥使其結(jié)構(gòu)更加伸展，從而降低了自由基攻擊分子時的空間位阻[21]，加速自由基的猝滅反應(yīng)，從而提升多糖的抗氧化活性。

圖12 植物乳桿菌Z22胞外多糖對·OH清除能力Fig.12 Scavenging activity of extracellular polysaccharide of L.plantarum Z22 on hydroxyl radical

圖13 植物乳桿菌Z22胞外多糖對清除能力Fig.13 Scavenging activity of extracellular polysaccharideL. plantarum Z22 on superoxide radical

2.7 功能性評價分析

表1 植物乳桿菌功能性評價結(jié)果Table 1 Results of gastrointestinal survival and benificial properties of L.plantarum

注：“—”表示文獻中無記錄；E～K分別代表L.plantarumZ22、L.plantarumEM[24]、L.plantarumS4-1[25]、L.plantarumNDC 7501[2]、L.plantarumC88[26]、L.plantarum70810[27]和L.plantarumYW32[28]。

3 結(jié)論

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Gastrointestinal survival and beneficial properties in vitro of Lactobacillus plantarum strains

XIONG Qiang,WANG Kai,WANG Yanbin

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Lactobacillusplantarum; extracellular polysaccharide;antioxidant activity

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.009

2016-05-16

江蘇省重點研發(fā)項目(BE2015305)

熊 強(1970—),男,江蘇南京人,副教授,研究方向:微生物與發(fā)酵工程,E-mail:xiongqiang@njtech.edu.cn

TS252.1

A

1672-3678(2016)06-0046-08