于華平，趙 鸝，程曉建，王燕飛，徐偉軍

（1. 浙江廣播電視大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 310030；2. 浙江省龍泉市林場(chǎng)，浙江 龍泉 323700）

人工繪制品種鑒別圖法鑒定榧樹(shù)屬植物

于華平1，趙 鸝1，程曉建1，王燕飛2，徐偉軍2

（1. 浙江廣播電視大學(xué)農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 310030；2. 浙江省龍泉市林場(chǎng)，浙江 龍泉 323700）

以19個(gè)榧樹(shù)屬植物的嫩葉為試驗(yàn)材料，采用改良CTAB法進(jìn)行DNA提取，選用11個(gè)堿基組成的隨機(jī)引物并篩選退火溫度對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性（RAPD）分析，根據(jù)特異性譜帶構(gòu)建相應(yīng)的圖譜關(guān)系，通過(guò)人工繪制品種鑒別圖法（MCID），快速、準(zhǔn)確鑒別這19個(gè)榧樹(shù)屬植物。

MCID；榧屬；RAPD；鑒定

榧樹(shù)屬（Torreya）植物分布于北半球，北美產(chǎn)2種，日本1種，中國(guó)4種。榧樹(shù)（T. grandis）為我國(guó)特有樹(shù)種，其栽培種香榧（T. grandis cv. Merrillii）更是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，具有很高的觀賞價(jià)值和綜合利用價(jià)值。近年來(lái)，隨著各地快速發(fā)展，它的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益也明顯提高，在不斷的栽培和引種過(guò)程中，優(yōu)良品種和性狀也越來(lái)越多，這使得良種的區(qū)分也更加困難。因此，快速有效的鑒別榧樹(shù)屬植物對(duì)于它的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)、品種選育以及良種進(jìn)化都有著重要的意義。

對(duì)于榧樹(shù)屬植物品種的研究，經(jīng)歷了從宏觀的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究到微觀的細(xì)胞學(xué)鑒定再到比較精確的分子標(biāo)記鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定方法由于受到環(huán)境條件和自身發(fā)育的影響不適于眾多品種的區(qū)分鑒定；而在細(xì)胞水平上主要研究香榧的染色體組成、性別早期鑒定以及雌雄株的核型等方面。DNA分子標(biāo)記由于具有標(biāo)記數(shù)量眾多、簡(jiǎn)單、快速、不受時(shí)空和環(huán)境影響等特點(diǎn)，在品種鑒定方面有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[1～3]。譚曉風(fēng)等[4]利用RAPD技術(shù)對(duì)8個(gè)香榧栽培品種進(jìn)行系統(tǒng)的聚類(lèi)分析，結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)基本吻合；張黨權(quán)[5]同樣也對(duì)主栽的8個(gè)品種進(jìn)行了系統(tǒng)聚類(lèi)，并進(jìn)行品種劃分；戴正等[6]利用篩選出的12條引物分析多個(gè)實(shí)生品種和優(yōu)良無(wú)性系的遺傳關(guān)系。李紅等[7]從RAPD技術(shù)入手構(gòu)建了香榧的分子遺傳圖譜。這些研究?jī)H對(duì)品種的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，并沒(méi)有直接區(qū)分大量的品種，而且利用計(jì)算機(jī)聚類(lèi)分析獲得的進(jìn)化樹(shù)無(wú)法將多態(tài)性標(biāo)記與品種的區(qū)分建立直接的聯(lián)系。

人工繪制品種鑒別示意圖法[8～9]（manual cultivar identification diagram， MCID）是基于DNA標(biāo)記的新方法，不僅可以利用較少的引物將品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且還可以快速的從品種鑒別示意圖上利用不同的引物和譜帶的有無(wú)鑒定不同品種，能夠?qū)⒇S富的 DNA標(biāo)記信息轉(zhuǎn)化成可用于鑒定大量品種資源的有效信息。該方法在枇杷（Eriobotrya japonica）、杏（Armeniaca vulgaris）、梅（Armeniaca mume）、葡萄（Vitis vinifera）等果樹(shù)上已經(jīng)適用。Zhang等[9]用了6個(gè)隨機(jī)引物成功鑒定25個(gè)枇杷品種，并建立了MCID圖。Wang等[8]利用MCID法將54個(gè)花梅品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且僅用了17對(duì)杏與果梅的EST-SSR引物。張曉瑩等[10]用7次PCR就能夠?qū)?91個(gè)葡萄品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。王玉娟等[11]利用MCID法鑒定了72個(gè)葡萄品種。

人工繪制品種鑒別示意圖法，操作簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)，應(yīng)用在榧樹(shù)屬上，對(duì)今后苗木早期鑒定、品種權(quán)利保護(hù)[12]、生產(chǎn)中品種的區(qū)分、命名等研究都可以提供技術(shù)性指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料的選取

在香榧胚乳、幼果、老葉和嫩葉上對(duì)DNA提取進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果表明嫩葉上提取的效果較好[13]。因此，本研究以榧樹(shù)屬植物嫩葉為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)材料均采于浙江農(nóng)林大學(xué)香榧資源圃，共19個(gè)榧樹(shù)屬植物，材料編碼與名稱(chēng)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用榧屬植物名稱(chēng)Table 1 Plants for test

1.2 方法

1.2.1 榧樹(shù)屬植物嫩葉DNA的提取 采用改良CTAB法[14]進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 引物及退火溫度篩選 根據(jù)引物長(zhǎng)度對(duì)RAPD擴(kuò)增效果影響的研究結(jié)果，在眾多果樹(shù)樹(shù)種上11個(gè)堿基的引物要比9和10個(gè)堿基的引物的擴(kuò)增效果好[15]。因此，本試驗(yàn)采用11個(gè)堿基的引物用于榧樹(shù)屬植物的品種鑒定。同時(shí)，在35～45℃設(shè)置溫度梯度，對(duì)隨機(jī)引物進(jìn)行退火溫度篩選，從中篩選出了5個(gè)引物（見(jiàn)表2）。通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，把譜帶重復(fù)出現(xiàn)、清晰、雜帶較少的溫度作為退火溫度。

1.2.3 用MCID法快速鑒定品種 對(duì)19個(gè)榧樹(shù)屬植物的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)特異性譜帶的有無(wú)建立品種區(qū)分圖譜，快速鑒別品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 榧樹(shù)屬植物嫩葉DNA的提取

采用改良的CTAB法提取的嫩葉的DNA質(zhì)量較好，可用于日后的擴(kuò)增，見(jiàn)圖1。

2.2 引物篩選

圖1 19個(gè)榧樹(shù)屬植物DNA電泳示意圖Figure 1 DNA electrophoresis patterns of tested plants

根據(jù)引物的篩選條件即選擇 11個(gè)堿基且梯度 PCR擴(kuò)增條帶穩(wěn)定清晰的溫度作為退火溫度，從36個(gè)隨機(jī)引物中篩選出5條11個(gè)堿基的引物，見(jiàn)表2。從表2可知，這些引物擴(kuò)增的結(jié)果穩(wěn)定性和多態(tài)性都較好，符合后期品種鑒定的擴(kuò)增要求。

表2 引物及其退火溫度Table 2 RAPD primers and annealing temperature

2.3 D NA指紋圖譜統(tǒng)計(jì)以及品種鑒別的人工繪圖

圖2 用引物Y3擴(kuò)增的榧樹(shù)屬的19個(gè)榧樹(shù)屬植物的指紋圖譜Figure 2 Banding patterns of tested plants amplified by primer Y3

根據(jù)所篩選的某一條引物對(duì)所有榧樹(shù)屬植物的擴(kuò)增結(jié)果，把具有相同擴(kuò)增譜帶的品種劃分在一組，不相同的劃分為另一組；如果其中某一品種單獨(dú)具有或不具有某一特征譜帶，該品種就可以被單獨(dú)區(qū)分鑒別出來(lái)。 利用更多的引物將每一組的品種按照上述的方法逐步進(jìn)行鑒定，直至每個(gè)品種都被單獨(dú)區(qū)分出來(lái)[11]。最后，將所利用的引物和多態(tài)性譜帶的大小（bp）繪制成榧樹(shù)屬植物鑒定圖（圖3）。

從圖3可以看出，利用引物Y3對(duì)19個(gè)榧樹(shù)屬植物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)800 bp的特征性譜帶的有無(wú)將所測(cè)植物分成2組。第一組象牙榧、香榧12號(hào)、芝麻榧、香榧11號(hào)都沒(méi)有800 bp（-）特征譜帶；第二組香榧6號(hào)、舌葉榧、九龍山榧、浦江4號(hào)、巴山榧、香榧29號(hào)、龍鳳香榧、浦江5號(hào)、新昌1號(hào)、香榧14號(hào)、香榧4號(hào)、珍珠榧、新昌3號(hào)、榧樹(shù)雄株、巴山榧雄株有800 bp（+）特征譜帶；其中第一組的4個(gè)種再利用引物Y10進(jìn)行區(qū)分，象牙榧和香榧12號(hào)根據(jù)在1 200 bp和500 bp上多態(tài)性譜帶的有無(wú)被區(qū)分出來(lái)，芝麻榧和香榧11號(hào)由于譜帶一致被分為一組。芝麻榧和香榧11號(hào)用引物Y6在750 bp上譜帶的有無(wú)區(qū)分開(kāi)來(lái)。第二組的15個(gè)種利用1 300 bp、1 500 bp、800 bp、600 bp和750 bp譜帶的有無(wú)分成七7個(gè)亞組：香榧6號(hào)具有單獨(dú)的譜帶600 bp、浦江4號(hào)具有單獨(dú)的譜帶750 bp被單獨(dú)區(qū)分開(kāi)來(lái)，舌葉榧、巴山榧、新昌1號(hào)在1 500 bp、1 300 bp和800 bp譜帶上的有無(wú)被單獨(dú)區(qū)分。九龍山榧、龍鳳香榧、香榧14號(hào)、香榧4號(hào)、新昌3號(hào)、榧樹(shù)雄株、巴山榧雄株被分為一個(gè)組，香榧29號(hào)、浦江5號(hào)、珍珠榧為一個(gè)組，這兩個(gè)亞組都具有500 bp和700 bp兩個(gè)譜帶，但在800 bp和1 500 bp兩個(gè)譜帶上的差異使兩組區(qū)分開(kāi)來(lái)。其次用相同的方法用引物Y57將兩個(gè)亞組區(qū)分開(kāi)來(lái)，最后利用引物Y60將香榧14號(hào)、巴山榧雄株和香榧4號(hào)、新昌3號(hào)分別區(qū)分開(kāi)來(lái)。

3 結(jié)論與討論

在以前的研究中，針對(duì) RAPD技術(shù)存在穩(wěn)定性低的缺點(diǎn)，主要是從鎂離子濃度、模板濃度、PCR循環(huán)[16]條件等方面對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化。部分研究了引物濃度的影響了。本研究通過(guò)引物堿基數(shù)量的增加和退火溫度的篩選來(lái)優(yōu)化RAPD體系，建立一套穩(wěn)定性好、擴(kuò)增性強(qiáng)的體系。一般情況下，引物越短，模板序列兩端與引物互補(bǔ)的位點(diǎn)數(shù)量越多，也會(huì)引起模板互補(bǔ)配對(duì)穩(wěn)定性低的問(wèn)題。根據(jù)引物長(zhǎng)度對(duì)RAPD擴(kuò)增效果影響的研究，在很多果樹(shù)樹(shù)種上11個(gè)堿基的引物要比9和10個(gè)堿基的引物的擴(kuò)增效果好，本研究篩選了榧樹(shù)屬的11個(gè)堿基的隨機(jī)引物用于PCR擴(kuò)增。其次，在35～45℃設(shè)置溫度梯度進(jìn)行退火溫度篩選，將重復(fù)性好、條帶一致的溫度作為退火溫度。綜上兩點(diǎn)，堿基數(shù)量和退火溫度的選擇優(yōu)化了RAPD反應(yīng)體系，在很大程度上克服了RAPD技術(shù)穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，提高了品種鑒定的可靠性。

MCID法雖然在葡萄、枇杷等果樹(shù)上進(jìn)行應(yīng)用，有效的區(qū)分了大量品種，但在榧樹(shù)屬上還是首次通過(guò)優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系，利用5條引物將19個(gè)種的標(biāo)記信息轉(zhuǎn)化為實(shí)用性的有效信息。之前很多學(xué)者對(duì)于榧樹(shù)品種的鑒定只是針對(duì)少數(shù)主栽品種，而且使用的引物數(shù)量也較多，在引物的堿基數(shù)量上大多采用9～10個(gè)堿基的引物。MCID法只需要很少的引物就可以將品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，大大提高了引物的利用效率，同時(shí)該方法對(duì)實(shí)際生產(chǎn)也起了重要的指導(dǎo)作用。該方法還可以用在其他樹(shù)種的大量品種的鑒定上，是行之有效的方法，可以真正服務(wù)于榧樹(shù)屬植物的種苗企業(yè)、種質(zhì)資源管理、品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)等各個(gè)方面。

圖3 5個(gè)引物區(qū)分19個(gè)榧樹(shù)屬植物的圖譜關(guān)系示意圖Figure 3 Relationship of schematic map for identifying tested plants by 5 random primers

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Identification of Torreya Arn. by MCID Method

YU Hua-ping1，ZHAO Li1，CHENG Xiao-jian1，WANG Yan-fei2，XU Wei-jun2
（1. College of Agriculture, Zhejiang Radio & Television University, Hangzhou 310030, China; 2. Longquan Forest Farm of Zhejiang, Longquan 323700, China）

Random primers with the composition of 11 bases were selected for RAPD amplification of 19 species and cultivars of Torreya Arn., and corresponding map relationships were built according to the specific bands. Species were identified quickly and efficiently through drawing the diagram manual cultivar identification diagram (MCID).

MCID method; Torreya Arn.; RAPD；identification

S718.46

：A

1001-3776（2016）03-0019-05

2016-01-22；

：2016-04-18

浙江省教育廳科研項(xiàng)目“基于DNA標(biāo)記的人工示意圖法鑒定香榧品種”（Y201328649）

于華平（1986－），女，山東威海人，講師，從事果樹(shù)應(yīng)用基因組學(xué)研究，Email∶yuhuaping@zjtvu.edu.cn。