何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

凍存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前制備

何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

目的將凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）制備成一種復(fù)蘇后可直接用于臨床的制劑，并進(jìn)行質(zhì)量檢定。方法從種子細(xì)胞庫(kù)復(fù)蘇凍存的UC-MSCs，待細(xì)胞培養(yǎng)至P3代時(shí)，收集UC-MSCs，按照4×107/劑的規(guī)格加入含5%人血白蛋白、10%DMSO、85%復(fù)方電解質(zhì)溶液的細(xì)胞保護(hù)液，形成制劑，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢定，包括無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、免疫表型檢測(cè)、穩(wěn)定性檢測(cè)、異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)以及殘留物檢測(cè)。結(jié)果制備的UC-MSCs制劑無(wú)菌、無(wú)支原體污染，無(wú)內(nèi)外致病因子，毒素＜2 EU，能抑制異源淋巴細(xì)胞的增殖，抑制率隨臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量增加而增大。牛血清殘留＜50 ng/袋，制劑凍存前細(xì)胞活性＞90%，復(fù)蘇后活性＞85%。結(jié)論按照此方法制備的UC-MSCs制劑符合臨床治療要求的質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；制劑；制備；質(zhì)量檢定

臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)因具有來(lái)源廣泛、采集方便、不受供體年齡限制以及可以大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)[1]，而成為間充質(zhì)干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，可以用于治療脊髓損傷、腦缺血、移植物抗宿主病以及自身免疫性疾病等的治療[2-4]。隨著干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用，為了適應(yīng)臨床需要，各種干細(xì)胞產(chǎn)品相繼被開(kāi)發(fā)，作為一種新型的生物制劑。因?yàn)閔UC-MSCs具有活細(xì)胞屬性，從分離培養(yǎng)到鑒定最終形成制劑的每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能會(huì)影響其質(zhì)量，也直接決定著后續(xù)臨床治療的安全性和有效性。目前，已經(jīng)有較多關(guān)于hUC-MSCs制備以及治療方面的研究報(bào)告，但尚未建立制劑制備、檢定的技術(shù)規(guī)范以及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。所以需對(duì)hUC-MSCs制劑的制備進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究和質(zhì)量檢定。本課題在前期已經(jīng)建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化的UC-MSCs制備鑒定技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上形成標(biāo)準(zhǔn)化的hUC-MSCs細(xì)胞庫(kù)，本研究旨在如何將凍存的UC-MSCs制備成一種復(fù)蘇后可直接用于臨床的制劑，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 UC-MSCs來(lái)源于本中心干細(xì)胞庫(kù)；DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone公司），胎牛血清（FBS）和0.25%trypsin-EDTA（BI公司）；復(fù)方電解質(zhì)溶液（勃脈力A，上海百特醫(yī)療用品）；人血白蛋白（廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司）；DMSO（Bioniche Pharman,USA LLC公司）；低分子肝素鈣（葛蘭素史克有限）；鱟試劑及檢查用水（湛江安度斯生物有限公司）；內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、MP、TP熒光定量PCR試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；豬細(xì)小病毒檢測(cè)試劑盒（西班牙Ingenasa公司）；定量檢測(cè)牛血清白蛋白（BSA）試劑盒（Cygnus）；MTS檢測(cè)試劑盒（Promega公司）。

1.2 種子細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮罐中取出hUCMSCs凍存管，核對(duì)好批號(hào)后，迅速置于37℃水浴中，期間不斷晃動(dòng)，使管中的細(xì)胞懸液迅速融化，待細(xì)胞懸液完全融化后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入10倍體積以上的生理鹽水低速離心，除去上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。胎盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性、計(jì)數(shù)。之后接種培養(yǎng)瓶，放入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3 hUC-MSCs制劑的制備 取第3代細(xì)胞(P3)計(jì)數(shù)，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。當(dāng)活性大于90%時(shí)，按照4×107/劑的規(guī)格，加入含有5%人血白蛋白、10%的DMSO的勃脈力A 20 ml，充分混勻后緩慢裝入凍存袋中，待細(xì)胞完全裝入袋后，輕輕擠壓凍存袋排除多余氣體，然后密封，貼好標(biāo)簽，注明生產(chǎn)批號(hào)、生產(chǎn)日期、規(guī)格。把密封好的袋裝制劑放入程序降溫盒中，置于-70℃冰箱，24 h后移入液氮中保存?zhèn)溆谩ＥR床擬使用劑量為：1×106個(gè)/kg。臨床使用時(shí)，把凍存袋從液氮取出迅速置于37℃水浴中，期間不斷晃動(dòng)凍存袋，使其中的細(xì)胞懸液快速融化。待細(xì)胞懸液完全融化后，仔細(xì)核對(duì)袋上標(biāo)簽注明的批號(hào)、姓名、數(shù)量，確認(rèn)后用勃脈力A進(jìn)行五倍稀釋?zhuān)⒏鶕?jù)1050 IU/（4×107）個(gè)細(xì)胞添加低分子肝素鈣，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 hUC-MSCs的質(zhì)量檢定

1.4.1 無(wú)菌檢測(cè) 采用全自動(dòng)微生物培養(yǎng)法，取適量制劑懸液加入需氧培養(yǎng)瓶和厭氧培養(yǎng)瓶中，置于全自動(dòng)微生物培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)，37℃培養(yǎng)。

1.4.2 病原體檢測(cè) 采用定量PCR法檢測(cè)支原體；采用Q-PCR法檢測(cè)人源特定病毒（HIV、HBV、HCV、EBV、CMV）；采用ELISA法檢測(cè)豬細(xì)小病毒；依據(jù) 《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版三部附錄ⅫB細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢測(cè)內(nèi)毒素。

1.4.3 牛血清殘留量檢測(cè) 使用定量檢測(cè)牛血清白蛋白（BSA）酶聯(lián)免疫試劑盒，對(duì)制劑的牛血清殘留量進(jìn)行檢測(cè)。每次檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)有效性確認(rèn)。判定標(biāo)準(zhǔn)為每個(gè)制劑中牛血清殘留量≤50 ng。

1.4.4 異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè) 制劑按照1×104個(gè)/ml hUC-MSCs接種于6孔板中，2 h貼壁后，按照hUCMSCs∶外周血T淋巴細(xì)胞（PBLCs）為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20的比例加入PBLCs，在PHA刺激的作用下，培養(yǎng)72 h后，MTS一步法檢測(cè)UC-MSCs對(duì)CD3+T淋巴細(xì)胞增殖抑制作用。

1.4.5 穩(wěn)定性檢測(cè) 分別于制劑凍存后的2 w、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月后，分別復(fù)蘇同一批號(hào)的細(xì)胞，計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)量，胎盼藍(lán)染色后檢測(cè)其活性。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)蘇后hUC-MSCs的形態(tài)觀(guān)察 復(fù)蘇后的hUC-MSCs，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察呈圓形透亮的單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2 h逐漸貼壁；3～4 d換液1次，待細(xì)胞均勻分布生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，可見(jiàn)大量成纖維樣細(xì)胞呈漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下hUC-MSCs（P3）形態(tài)

2.2 hUC-MSCs制劑的制備 hUC-MSCs制劑是一種復(fù)蘇后直接用于臨床治療的細(xì)胞制劑，所以需對(duì)制劑制備過(guò)程進(jìn)行原始記錄并存檔（圖2）。規(guī)格：4×107/20 ml/袋；性狀：微黃色細(xì)胞混懸液；包裝：凍存袋；保存方式：液氮保存。

圖2 hUC-MSCs制劑

2.3 hUC-MSCs制劑質(zhì)量檢定結(jié)果 從表1可見(jiàn)，各檢測(cè)項(xiàng)目全部合格。

2.4 hUC-MSCs制劑的異常免疫學(xué)反應(yīng) 從圖3可見(jiàn)，hUC-MSCs制劑對(duì)人T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用，且抑制作用隨著hUC-MSCs數(shù)量的增加而增大。

2.5 hUC-MSCs制劑的穩(wěn)定性 從表2可見(jiàn)，hUC-MSCs制劑保存2 w～6個(gè)月，hUC-MSCs制劑中的細(xì)胞數(shù)量和活性沒(méi)有顯著變化。

圖3 PHA刺激后hUC-MSCs對(duì)CD3+T淋巴細(xì)胞增殖抑制作用

3 討論

基于干細(xì)胞廣泛的應(yīng)用前景，為適應(yīng)臨床使用的需要，各種干細(xì)胞制品制劑不斷被開(kāi)發(fā)而推向市場(chǎng)，干細(xì)胞制劑越來(lái)越多的應(yīng)用于細(xì)胞治療的領(lǐng)域。目前為止，國(guó)際上已有多款的相關(guān)干細(xì)胞產(chǎn)品上市并批準(zhǔn)進(jìn)入臨床[5]，這些都標(biāo)志著干細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)向著藥物的方向發(fā)展。在我國(guó)，干細(xì)胞臨床研究已是如火如荼，但由于細(xì)胞來(lái)源和各實(shí)驗(yàn)室制備條件的差異，對(duì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量還缺乏系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)和規(guī)范性的要求。2015年8月，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委和國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布了《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則 (試行)》，目的就是要規(guī)范干細(xì)胞制劑的臨床前研究、確保干細(xì)胞制劑的質(zhì)量可控性以及治療的安全性和有效性。本研究制備的臨床級(jí)hUC-MSCs制劑，是將一定濃度的干細(xì)胞懸液與細(xì)胞凍存保護(hù)液按比例混合制備后，分裝于適宜冷凍的凍存袋，放于液氮中保存，復(fù)蘇后可直接用于臨床的制劑。作為一種不同于傳統(tǒng)藥物制劑的全新藥物制劑形式，因?yàn)槠渚哂谢罴?xì)胞屬性，所以有非常強(qiáng)的特殊性，更需要通過(guò)全面的質(zhì)量檢測(cè)和控制。

表1 hUC-MSCs制劑質(zhì)量檢定結(jié)果

表2 hUC-MSCs制劑質(zhì)量穩(wěn)定性結(jié)果

在干細(xì)胞制劑的臨床應(yīng)用中，最基本的要求就是確保制劑的無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素、無(wú)內(nèi)外源致病因子。在本研究中，細(xì)菌和內(nèi)毒素檢測(cè)參照了2010版藥典規(guī)定的方法檢測(cè)，方法簡(jiǎn)易又經(jīng)濟(jì)，有可操作性和實(shí)用性。在對(duì)內(nèi)外源致病因子的檢測(cè)中，除了豬細(xì)小病毒，均采用了定量PCR的方法，從基因水平對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，確保安全。但由于有些病毒存在窗口期的問(wèn)題，所以關(guān)鍵措施還是需要完善供者信息以便之后隨訪(fǎng)，排除病毒處在窗口期漏檢的因素。

近幾年來(lái)，免疫調(diào)節(jié)成為間充質(zhì)干細(xì)胞最受關(guān)注的原因之一，因?yàn)槠涿庖咴缘颓冶旧砭哂忻庖哒{(diào)節(jié)功能，可以抑制T、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的成熟和功能[6-8]，因此，不論是自體還是同種異體的MSCs，用于治療一般都不會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)，本研究應(yīng)用MTT法檢測(cè)了異體來(lái)源的UC-MSCs對(duì)于人T淋巴細(xì)胞的抑制作用，對(duì)于監(jiān)測(cè)UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)功能提供了簡(jiǎn)便可行的檢測(cè)方法，保證了臨床使用的有效性。

干細(xì)胞制劑最突出的特點(diǎn)就是有效性成分是活細(xì)胞，能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的前提是具有一定穩(wěn)定性，因此，長(zhǎng)期在液氮保存，其活性需要長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)。本研究對(duì)制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的活性在凍存后2 w～6個(gè)月復(fù)蘇后檢測(cè)其活性，均不低于90%。

此外，牛血清是培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基的添加物，根據(jù)《指導(dǎo)原則》在制劑制備過(guò)程中堅(jiān)持少加甚至不加的原則，盡可能少引入異源的病毒和致敏源，因此，對(duì)牛血清的殘留需控制在一定范圍內(nèi)來(lái)確保制劑的安全性。

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Pre-clinical preparation of cryopreserved UC-MSCs

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming,Yunnan,650032,China

[Abstract]Objective To prepare the cryopreserved umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs)into a kind of preparation that can be directly clinically used upon the resuscitation and to test the quality.MethodsThe cryopreserved UC-MSCs from the seed cell bank were resuscitated and collected when cultivated to P3-generation.The cell protective fluid containing 5% human serum albumin (HSA),10%DMSO and 85%compound electrolyte solution with a specification of 4×107/agent was added to form the preparation,the quality of which was tested,including sterility test,mycoplasma detection,internal and external pathogenic factor detection,endotoxin detection,immune phenotype detection,stability detection,abnormal immune response detection and residue detection.ResultsThe UC-MSCs preparation thus prepared was sterile without mycoplasma contamination or internal and external pathogenic factors,with poison＜2 EU.It could inhibit the proliferation of allogeneic lymphocytes,with the inhibition ratio increasing with the increase of the number of UC-MSCs.Bovine serum residue＜50 ng/bag;the cell activity of the preparation before cryopreservation＞90%;the cell activity after the resuscitation＞85%.ConclusionThe UC-MSCs preparation thus prepared is up to the quality test standard for clinical treatment.

UC;MSC;preparation;quality test

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1365-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.004

2016-07-04)

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B0）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com；潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com