王金祥，王小華，白盈盈，周 芳，蔡學(xué)敏，劉菊芬，李自安，余爭平，朱光旭，潘興華

Notch1基因沉默抑制骨髓源性脂肪祖細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化

王金祥，王小華，白盈盈，周 芳，蔡學(xué)敏，劉菊芬，李自安，余爭平，朱光旭，潘興華

目的探討Notch1對骨髓源性脂肪祖細(xì)胞(BMAPCs)向脂肪細(xì)胞分化的影響。方法無菌取SD大鼠股、脛骨骨髓制作細(xì)胞懸液，差速貼壁法培養(yǎng)，流式分析檢測細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time qPCR)檢測脂肪相關(guān)基因和Notch信號分子表達(dá)。Notch1基因沉默實(shí)驗(yàn)分為空載體組和Notch1小RNA干擾組。Western blotting檢測干擾效率；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit行細(xì)胞成脂誘導(dǎo)。結(jié)果BMAPCs表達(dá)CD34、CD44、CD45及CD90，且表達(dá)6種脂肪相關(guān)基因及Notch信號分子；成脂誘導(dǎo)促進(jìn)Notch1 mRNA表達(dá)（P＜0.01）；Notch1小RNA干擾抑制Notch1蛋白表達(dá)（P＜0.05）。Notch1小RNA干擾組的Cebpa、Lpl和Ppaγ、Slc2a4與Fabp4 mRNA表達(dá)均較對照顯著降低，而pread1 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05～P＜0.01）；Notch小RNA干擾顯著抑制脂肪細(xì)胞百分率（P＜0.05）。結(jié)論Notch1基因沉默抑制BMAPCs向成熟脂肪細(xì)胞分化。

骨髓源性脂肪祖細(xì)胞；造血干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；Notch1

最近本室從骨髓培養(yǎng)出一類細(xì)胞，該細(xì)胞有一定成骨分化和較強(qiáng)的成脂肪分化能力，表達(dá)造血干細(xì)胞 （hematopietic stem cells,HSCs）主要標(biāo)志CD34，也高表達(dá)脂肪相關(guān)基因，可高效分化為脂肪細(xì)胞，我們認(rèn)為可定義為脂肪祖細(xì)胞 (bone marrow adipocyte progenitor cells，BMAPCs)。關(guān)于Notch信號在干/祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化中的作用已有部分文獻(xiàn)報(bào)道，但是呈現(xiàn)一些比較矛盾的結(jié)論。文獻(xiàn)報(bào)道Notch1活化促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）分化為脂肪細(xì)胞[1]，但是另有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號活化會抑制ADSCs向脂肪細(xì)胞分化[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討Notch1在BMAPCs向脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1～2月齡健康雄性SD大鼠，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滇)2011-0004，使用許可證號為SYXK（滇）K2013-0011，均喂養(yǎng)于環(huán)境適中，飲食良好的環(huán)境。優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，PAA公司），STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2（EBM-2，Lonza），內(nèi)皮生長因子添加劑（ECGs, Millipore），GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、GoTaqqPCRMaster MiX（Progema公司），熒光標(biāo)記CD34(Abcam)，CD45、CD44、CD90抗體 (Ebioscience)，Notch 1 siRNA及siRNA Reagent System （Santa Cruz），PCR引物由奧科鼎盛生物有限公司合成。

1.2 BMAPC體外培養(yǎng) PBS沖洗SD大鼠股、脛骨骨髓，將懸液轉(zhuǎn)移到離心管，靜置8～10 min后轉(zhuǎn)移到另一離心管，離心棄上清，以EBM-2(含20% FBS、15 μg/ml ECGs及青、鏈霉素各100 U/ml)培養(yǎng)基吹打混勻，以1×107/cm2接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，連續(xù)兩次進(jìn)行細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移培養(yǎng)；對第三次貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每4 d換液一次，待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%～90%后，進(jìn)行傳代，取P3～P5細(xì)胞用于流式分析及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測基因表達(dá)

按照GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑說明，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為BMAPC組、空載體組和Notch1小RNA干擾組，提取mRNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，所獲得的cDNA用GoTaqqPCRMaster MiX，按照操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，Gel Doc 2000圖像掃描儀分析。引物序列見表1。

1.4 基因轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)的P4代細(xì)胞，待細(xì)胞長至約90%融合,參照RNA干擾說明書行基因轉(zhuǎn)染，18 h后去除轉(zhuǎn)染試劑,換上含正常EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后,Western blotting檢測RNA干擾效率。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 取Notch1干預(yù)的細(xì)胞，用PBS洗滌，PMSF裂解，將裂解液移至離心管，離心收集上清，蛋白定量、上樣，SDSPAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜室溫封閉，加入抗大鼠GAPDH抗體(1∶800)、Notch1(1∶600)，4℃孵育過夜，再與HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、抗鼠IgG 37℃孵育1 h，顯色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描,半定量分析顯影帶，目的蛋白量以GAPDH相對量表示。

1.6 成脂誘導(dǎo)分化 基因轉(zhuǎn)染48 h后加入新培養(yǎng)液，24 h后棄培養(yǎng)液，加入成脂肪分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每隔3 d換液，誘導(dǎo)14 d后，用4%多聚甲醛固定后加入油紅O進(jìn)行染色。DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，計(jì)算脂肪細(xì)胞百分率，計(jì)算公式為：脂肪細(xì)胞百分率=油紅O染色陽性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以Mean±SD表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行組間單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMAPCs的生長特征 第三次貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至第3 d，少部分細(xì)胞變?yōu)樗笮危▓D1A），至第5 d，大部分細(xì)胞形態(tài)均變?yōu)樗笮位蜷L三角狀（圖1B），至第10 d，細(xì)胞呈融合生長狀態(tài)（圖1D）。除P0～P2外，P3～P7細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)脂肪相關(guān)基因包括過氧化物酶體增殖激活受體γ（Ppaγ）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fFabp4）、脂蛋白脂肪酶（Lpl)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（Cebpa）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Slc2a4）以及前脂肪細(xì)胞因子1（pread1）(圖1G)。流式分析表明細(xì)胞表達(dá)CD34、CD44、CD45以及CD90（圖1I）。取P4細(xì)胞進(jìn)行成脂肪分化誘導(dǎo)（圖1H），誘導(dǎo)后第8 d成脂率為（87.2±11.67）%(n=6)。

2.2 成脂分化誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的 Notch1 mRNA在BMAPCs表達(dá) JAG1、2及 Notch1～3均表達(dá)于BMAPCs（圖2）。與0 d相比為（1.000±0.241）%，對BMAPCs進(jìn)行成脂肪分化誘導(dǎo)第2 d，Notch1 mRNA表達(dá)顯著增加（2.636±0.375）%（n=4,P＜0.01），到第4 d有所下降（1.495±0.252）%（n=4,P＜0.05）。

圖1 BMAPCs的生長特征

圖2 Notch信號分子在BMAPCs表達(dá)以及成脂誘導(dǎo)對Notch1 mRNA在BMAPCs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

2.3 Notch1 RNA干擾下調(diào)Notch1蛋白在BMAPCs表達(dá) 基因轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行Western blotting檢測，Notch1小RNA干擾組蛋白表達(dá)量（39.4±4.2）%較空載體組顯著降低（49.7±5.8）%（n=4,P＜0.05）（圖3）。

圖3 基因轉(zhuǎn)染72 h后檢測BMAPCs Notch1蛋白表達(dá)

2.4 Notch1 RNA干擾調(diào)節(jié)BMAPCs脂肪分化基因表達(dá)及抑制其脂肪細(xì)胞分化 成脂誘導(dǎo)至第3 d，可見對照組疑似脂肪細(xì)胞數(shù)目較Notch siRNA組明顯增加，誘導(dǎo)至第5 d，對照組內(nèi)疑似脂肪細(xì)胞數(shù)和油滴大小與Notch siRNA組相差更為明顯 （圖4A）。成脂誘導(dǎo)第5 d，Notch siRNA組的Cebpa、Lpl、Ppaγ、Slc2a4與Fabp4 mRNA(分別為0.87%±0.04%、0.76%± 0.11%、0.81%±0.06%、0.86%±0.08%、0.71%±0.04%）表達(dá)均較對照（分別為1.00%±0.04%、1.00%±0.09%、1.00%±0.04%、1.00%±0.07%、1.00%±0.09%）顯著降低，而pread1 mRNA表達(dá)（1.16±0.03）%則較對照（1.00± 0.04）%顯著增加（n=4,P＜0.05～P＜0.01）。誘導(dǎo)第5 d(圖4B)，與對照組的 （49.7±5.8）%比較，Notch siRNA組（39.4±4.2）%脂肪細(xì)胞百分率顯著降低（n= 4,P＜0.05）。

圖4 Notch1 RNA干擾調(diào)節(jié)BMAPCs脂肪分化基因表達(dá)及抑制其成脂分化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞既表達(dá)HSCs的主要標(biāo)志CD34和脂肪相關(guān)特異性基因，又可高效分化為脂肪細(xì)胞，因此我們將此細(xì)胞定義為BMAPCs。實(shí)驗(yàn)表明 Notch信號分子包括配體 JAG1、2以及受體Notch1～3均表達(dá)于BMAPCs，成脂肪誘導(dǎo)顯著促進(jìn)Notch1 mRNA在BMAPCs表達(dá)，提示Notch1可能在BMAPCs向脂肪細(xì)胞分化中也起促進(jìn)作用[1]。

本研究結(jié)果顯示，Notch1基因沉默顯著影響B(tài)MAPCs成脂肪分化能力，誘導(dǎo)至第3 d，在光鏡下觀察到對照組的疑似脂肪細(xì)胞數(shù)目較Notch siRNA組明顯增加，至第5 d對照組內(nèi)疑似脂肪細(xì)胞數(shù)和油滴大小與Notch siRNA組相差更為顯著。與對照相比，Notch1基因沉默顯著抑制Cebpa、Lpl、Ppaγ、Slc2a4和Fabp4，而促進(jìn)pread1 mRNA表達(dá)，Notch siRNA顯著降低脂肪細(xì)胞百分率，表明Notch siRNA顯著抑制BMAPCs向脂肪細(xì)胞分化。

Notch通路成員作用較為復(fù)雜，同一Notch信號分子在不同細(xì)胞或同一細(xì)胞的不同分化階段功能可能完全不同，如Notch2可能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，而Notch3卻促進(jìn)SMCs增殖[3]；即使同一受體在不同類型細(xì)胞中作用也有所不同，Notch1在某些腫瘤的是癌基因，但是在其他類型腫瘤中則可能為抑癌基因[4]。既往關(guān)于Notch信號在干/祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化中的作用出現(xiàn)的矛盾結(jié)論，可能源于并未探討該通路中具體某一受體或配體的詳細(xì)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch1基因沉默抑制BMAPCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，從一側(cè)面證實(shí)了Notch1活化促進(jìn)BMAPCs向脂肪細(xì)胞分化，為脂肪組織再生機(jī)制提供了部分新的理論基礎(chǔ)。

[1] Ba K,Yang X,Wu L,et al.Jagged-1-mediated activation of notch signalling induces adipogenesis of adipose-derived stem cells[J].Cell Prolif,2012,45(6):538-44.

[2] Osathanon T,Subbalekha K,Sastravaha P,et al.Notch signalling inhibits the adipogenic differentiation of single-cell-derived mesenchymal stem cell clones isolated from human adipose tissue [J].Cell Biol Int,2012,36(12):1161-1170.

[3] Baeten JT,Lilly B.Differential regulation of NOTCH2 and NOTCH3 contribute to their unique functions in vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,2015,290(26):16226-16237.

[4] Fan X,Mikolaenko I,Elhassan I,et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth[J].Cancer Res, 2004,64(21):7787-7793.

[5] Song BQ,Chi Y,Li X,et al.Inhibition of Notch signaling promotes the adipogenic differentiation of mesenchymal stem cellsthrough autophagy activation and PTEN-PI3K/AKT/mTOR pathway[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(5):1991-2002.

Inhibition of adipocyte differentiation of BMAPCs to mature fat cells by Notch1 gene silencing

Wang Jinxiang1,Wang Xiaohua2,Bai Yingying1,Zhou Fang1,Cai Xuemin1,Liu Jufen1,Li Zi'an1,Yu Zhengping3,Zhu Guangxu1,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032, China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming, Yunnan,650032,China;Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University, Kunming,Yunnan,650032,China;2.Material Evidence Identification Center of Chongqing Public Security Bureau Yuzhong District Branch,Chongqing,400013,China;3.Research Institute of Biological Effects of Electromagnetic Radiation,Preventive Medicine College of the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China

Objective To explore the effects of Notch1 on the adipocyte differentiation of bone marrow adipocyte progenitor cells(BMAPCs).MethodsThe femoral and tibial bone marrow of SD rats was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension, which was cultivated by differential adhesion method.The cell surface marker expression was analyzed and detected by flow analysis; the molecular expression of adipose related genes and Notch signaling was detected by means of real-time qPCR.Notch1 gene silencing experiment was divided into non-carrier group and Notch1 small RNA interference group.The interference efficiency was detected by Western blotting;cell fat induction was conducted by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.ResultsBMAPCs expressed CD34,CD44,CD45 and CD90,and six fat-related genes and Notch signaling molecule;fat induction promoted the expression of Notch1 mRNA(P＜0.01);Notch1 small RNA interference inhibited the expression of Notch1 protein(P＜0.05).The levels of Cebpa,Lpl and Ppaγ,Slc2a4 and Fabp4 mRNA in Notch1 small RNA interference group were significantly lower than those in the control group,while the level of pread1 mRNA increased greatly(P＜0.05～P＜0.01);Notch small RNA interferencesignificantly inhibits the percentage of fat cells(P＜0.05).ConclusionNotch1 gene silencing inhibits the BMAPCs from differentiating into mature fat cells.

BMAPC;HSC;MSC;Notch1

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1374-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.007

2016-07-04）

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B00）；國家自然科學(xué)基金（No.81170316）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20111HB050，2013DA004）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心、干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室、云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、昆明醫(yī)科大學(xué)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院（王金祥，白盈盈，周 芳，蔡學(xué)敏，劉菊芬，李自安，朱光旭，潘興華）；重慶市公安局渝中區(qū)分局物證鑒定所（王小華）；第三軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院電磁輻射生物學(xué)效應(yīng)研究所（余爭平）

朱光旭：E-mail:zhguxu@aliyun.com；潘興華:E-mail:panxinghua@aliyun.com