蔡學敏，朱向情，沈麗蓉，趙 晶，何 潔，龐榮清，潘興華

DC-CTL免疫細胞對4種惡性腫瘤治療療效觀察

蔡學敏，朱向情，沈麗蓉，趙 晶，何 潔，龐榮清，潘興華

目的初步觀察自體DC-CTL免疫細胞回輸對4種惡性腫瘤治療的臨床療效。方法50例腫瘤患者分為4組，乳腺癌組12例，肺癌組27例，結(jié)直腸癌組8例，卵巢癌組3例。分離患者外周血單個核細胞(PBMC)，分別誘導培養(yǎng)細胞毒T淋巴細胞(CTL)、樹突狀細胞(DC)，誘導培養(yǎng)細胞達足夠數(shù)量后回輸給患者。分別在治療前后采用流式細胞術(shù)檢測患者外周血淋巴細胞CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和腫瘤標志物的變化，采用主觀問卷調(diào)查對卡氏行為能力(KPS)進行評分，并對治療療效進行評價。結(jié)果治療1個月后，總有效率達82.0%，且未見明顯副作用。治療后1 w，各組外周血CD3、CD4、CD8均顯著升高（P＜0.05），而CD4+/CD8+無顯著變化；各組外周血NK、CIK和KPS評分均顯著升高（P＜0.05），而CEA、FRP、CA19，CA153均較治療前明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論自體免疫細胞治療對改善惡性腫瘤患者生活質(zhì)量，提高患者的免疫功能有明顯作用，且安全性好，為惡性腫瘤的治療提供了一個新的方向。

樹突狀細胞；細胞毒T細胞；免疫細胞治療；療效

免疫細胞治療是一種獨特的生物治療技術(shù)，可以利用免疫系統(tǒng)中功能最強的抗原遞呈細胞樹突狀細胞(dendritic cell,DC），攝取抗原后，刺激CD8+T細胞和CD4+T細胞活化，增加殺傷活性[1]。我科從2013年獲原總后衛(wèi)生部批準開展免疫細胞治療臨床試驗和臨床應(yīng)用，本研究采用自體DC-CTL免疫細胞回輸?shù)姆椒?，?0例惡性腫瘤患者進行細胞治療，對前期治療效果進行初步總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選擇本院住院腫瘤患者50例，男18例，女32例，年齡32～77歲。按照患者的腫瘤診斷分為4組，其中乳腺癌組12例，肺癌組27例，結(jié)直腸癌組8例，卵巢癌組3例。多為臨床上Ⅱ、Ⅲ期分期患者，均接受過化療，其中乳腺癌組8例做過手術(shù)，肺癌組11例做過手術(shù)，結(jié)直腸癌組4例做過手術(shù)，卵巢癌組1例做過手術(shù)。在接受本治療前20 d，終止任何放療或化療，并測定外周血T細胞亞群(CD3、CD4、CD8)，檢測相關(guān)腫瘤標志物，進行影像學、血常規(guī)等檢查。

1.2 治療方案 參照原總后衛(wèi)生部 “軍隊醫(yī)院第三類醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法”開展自體免疫細胞治療，每例治療3個療程，每療程回輸DC細胞數(shù)為（1～5）×106個細胞，接連2 d；每次回輸細胞毒T淋巴細胞(CTL)數(shù)≥1×109，每療程回輸細胞總數(shù)＞5×109。

1.3 免疫細胞制備方法[2]無菌采集患者外周血80～100 ml，檸檬酸抗凝30 min。用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，使細胞密度為2×109個/L，加入細胞培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄上清，以37℃預(yù)溫的培養(yǎng)液RPMI-1640輕洗去除非貼壁細胞，非貼壁細胞倒入另一培養(yǎng)瓶，用無血清培養(yǎng)基AIM-V調(diào)整細胞密度為1×109個/L，進行CTL細胞的誘導。同時用無菌細胞刮刮取貼壁的黏附細胞，再以無血清培養(yǎng)基AIM-V調(diào)整細胞密度為1×109個/L。

1.3.1 DC細胞的體外誘導 （1）向黏附細胞懸液中加入rhGM-CSF和rhIL-4，細胞因子的應(yīng)用濃度均為50 μg/L，進行DC誘導培養(yǎng)：隔天進行半量換液，補充細胞因子，培養(yǎng)5 d后加入TNF-a，濃度均為50 μg/L，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。（2）在誘導DC的過程中，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。（3）7 d后收集懸浮的細胞，用無菌生理鹽水洗滌3次，1500 r/min離心10 min，去掉上清，細胞懸于20 ml生理鹽水中，顯微鏡下計數(shù)，細胞數(shù)應(yīng)大于107。檢查無菌、無其他污染后，對患者進行細胞回輸治療，同時可分析DC的表型及功能。

1.3.2 CTL細胞的誘導 （1）向未貼壁細胞懸液中加入INF-γ，細胞因子的應(yīng)用濃度為2000 U/ml，培養(yǎng)24 h。（2）加入rhIL-2濃度為2000 U/ml，PHA濃度為40 μg/ml，CD3單抗?jié)舛葹?00 ng/ml，隔天進行半量換液，補充細胞因子，培養(yǎng)到第8 d。（3）收集細胞，用無菌生理鹽水洗滌3次，1500 r/min離心10 min，去掉上清，細胞懸于20 ml生理鹽水中，顯微鏡下計數(shù)，細胞數(shù)應(yīng)大于109。檢查無菌、無其他污染后，對患者進行細胞回輸治療。

1.4 觀察指標 分別在治療前和治療后1 w，采用流式細胞術(shù)檢測患者外周血CD3+、CD4+、CD8+水平和腫瘤標志物，并采用主觀問卷調(diào)查對卡氏行為能力(KPS)進行評分。

1.5 療效評定 治療結(jié)束后1個月，參照WHO實體腫瘤療效評定標準：完全緩解(CR)：所有可見病變完全消失并至少維持 4 w；部分緩解(PR)：腫瘤基線病灶長徑總和縮小30%；穩(wěn)定(SD)：腫瘤基線病灶長徑總和有縮小但未達PR，或有增加但未達PD；進展(PD)：腫瘤基線病灶長徑總和增加 20%或出現(xiàn)新病灶。有效率=[(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)]×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料組間比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各組臨床療效比較［n(%）］

2 結(jié)果

2.1 臨床治療效果 治療總有效率達82.0%（表1），觀察期間未見明顯毒副作用，僅2例輸入細胞后出現(xiàn)低熱，體溫38℃，2 h后自行緩解。

2.2 治療前后各組相關(guān)檢測指標的變化 治療后1 w，各組外周血CD3+、CD4+、CD8+均顯著升高（P＜0.05），而CD4+/CD8+無顯著變化（P＞0.05），見表2。

治療后1 w，各治療組外周血NK、CIK和KPS評分均顯著升高（P＜0.05，表3）。

治療后1 w，各組CEA、FRP、CA19，CA153均較治療前明顯下降（P＜0.05，表4）。

3 討論

腫瘤已經(jīng)是威脅我國人民生命的主要疾病，全國每年新增腫瘤患者約220萬，每年約有180萬人死于腫瘤，占總死亡人數(shù)的1/5，占總死因的第2位，在城市占第1位[3]。

DC-CTL細胞過繼免疫治療就是通過抽取、分離患者外周血中的單個核細胞，在體外添加特異組合的細胞因子及單克隆抗體進行誘導培養(yǎng)，獲取大量有抗腫瘤活性DC和CIK細胞，并可分泌多種有抗腫瘤活性細胞因子，回輸?shù)襟w內(nèi)后達到直接殺傷體內(nèi)殘余腫瘤細胞，預(yù)防復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及提高患者機體免疫功能，并可產(chǎn)生免疫記憶保護，達到更長久的抗腫瘤效果[4]。DC-CTL細胞治療腫瘤安全有效，特別是對于手術(shù)后的腫瘤患者，對清除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶、防止癌細胞的擴散和復(fù)發(fā)、提高患者自身免疫力等具有重要作用。對于已擴散轉(zhuǎn)移、無法承受手術(shù)、放療、化療的嚴重腫瘤患者，也可單獨使用免疫療法或聯(lián)合使用免疫療法，可以大大提高患者的承受能力及提高化療、放療的療效，降低放療、化療的毒副作用，減輕痛苦，提高患者的生存質(zhì)量[5]。

表2 各組治療前后外周血T細胞的變化

表3 各組治療前后外周血免疫細胞和KPS評分變化

表4 各組治療前后外周血腫瘤標志物的變化

本研究對本院住院50例惡性腫瘤患者進行免疫細胞治療，治療后，患者的KPS評分有顯著提高，患者生活質(zhì)量均有改善，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)。淋巴細胞免疫功能分析，CD4+、CD8+細胞比例和數(shù)量增加，免疫功能明顯改善。從目前的療效來看，手術(shù)、放療、化療后的患者，腫瘤負荷較小，相對效果更好。對于腫瘤Ⅳ期的患者，由于腫瘤負荷較大，自身免疫功能低下，細胞活性不高，相對治療效果較差，但對生活質(zhì)量的提高及延長生命有一定作用。因此，免疫細胞治療應(yīng)該積極配合其他傳統(tǒng)治療，對腫瘤采取綜合治療的手段，療效更佳[6]。

另外免疫細胞治療相對安全，無毒副作用，僅2例輸入細胞后出現(xiàn)低熱（38℃），2 h后自行緩解。但目前DC-CTL細胞治療也面臨著一些問題，例如如何提高DC細胞抗原靶向性；腫瘤細胞免疫逃逸的機制復(fù)雜，有時DC細胞難以捕獲有效抗原；此外DC細胞的誘導效率低，也是免疫細胞治療的瓶頸問題。現(xiàn)在有許多直接轉(zhuǎn)入相關(guān)的腫瘤抗原基因到DC的方法進行嘗試，也有在DC細胞中轉(zhuǎn)入IL-12的基因[7]，加強抗原提呈的效果，也取得了一定的成效，但仍需進一步的深入研究。

[1] Kawakami Y.Cancer treatment by comprehensive regulation of anti-tumor immune network[J].Nippon Rinsho,2010,68(6):1094-1099.

[2] 蔡學敏 ，朱向情，劉凌，等.人外周血樹突狀細胞的誘導、鑒定及活性測定[J].中華細胞與干細胞雜志(電子版),2012，2(4): 231-236.

[3] 陳萬青，鄭榮壽，曾紅梅,等.2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2015,24(1):1-10.

[4] Wang X,Yu W,Li H,et al.Can the dual-functional capability of CIK cells be used to improve antitumor effects[J]?Cell Immunol, 2014,287:18-22.

[5] Pan K，Wang QJ，Liu Q，et al．The phenotype of exvivo generated cytokine-induced killer cells is associated with overall survival in patients with cancer[J]．Tumour Biol，2014，35(1):701-707.

[6] Chenhong Zheng,Ganjun Yu,Hui Wang,et al.Meta-analysis of chemotherapy and dendritic cells with cytokine-induced killer cells in the treatment of non-small-cell lung cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(8):14527-14537.

[7] Zhu H,Yang X,Li J,et al.Immune response,safety,and survival and quality of life outcomes for advanced olorectal cancer patients treated with dendritic cell vaccine and cytokine-induced killer cell therapy[J].Biomed Res Int,2014, 603871-603875.

Efficacy of DC-CTL immunological cells on treatment of four malignant tumors

Cai Xuemin,Zhu Xiangqing,Shen Lirong,Zhao Jing,He Jie,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming, Yunnan,650032,China

Objective To preliminarily observe the efficacy of autologous DC-CTL immunological cell infusion on the treatment of four malignant tumors.MethodsA total of 50 tumor patients were divided into four groups:the breast cancer group (n=12),the lung cancer group(n=27),the colorectal cancer group(n=8)and the ovarian cancer group(n=3).The peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of the patients were separated for respective induced culture of CTLs and dendritic cells(DCs).The cells thus cultured were infused to the patients when the number of such cells was adequate.The changes of CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+and tumor markers in peripheral blood lymphocyte (PBLs)of the patients were detected by flow cytometry before and after the treatment. Subjective questionnaire was conducted to score the KPS and evaluate the efficacy.ResultsOne month after the treatment,the ORR reached 82.0%without any obvious side effects.One week after the treatment,the CD3,CD4 and CD8 in the peripheral blood(PB)in all groups increased significantly(P＜0.05),while CD4+/CD8+showed no obvious change;the scores pf NK,CIK and KPS in the PB in all groups increased greatly(P＜0.05),while CEA,FRP,CA19 and CA153 were much lower than those before the treatment(P＜0.05).ConclusionAutologous immune cell therapy is significantly effective and highly safe on the improvement of the quality of life of tumor patients and their immunologic function,providing a new direction for the treatment of malignant tumors.

DC;CTL;immune cell therapy;efficacy

R 318.1/730.5

A

1004-0188（2016）12-1371-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.006

2016-07-05)

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B0）；國家973計劃項目（2012CB5181060）；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫(yī)學研究重點實驗室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com;龐榮清,E-mail: pangrq2000@aliyun.com