胡玉龍，徐 慧,2，劉艷秋，李寧川，陳志軍，昝 銷(xiāo)

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響及CBP的調(diào)控作用

胡玉龍1，徐 慧1,2，劉艷秋3，李寧川1，陳志軍1，昝 銷(xiāo)1

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞增殖的激活和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白綁定蛋白(CBP)在其中的調(diào)控作用。方法：采用游泳訓(xùn)練(Swim)2周構(gòu)建運(yùn)動(dòng)性心肌肥大模型，采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(TAC)2周構(gòu)建病理性心肌肥大模型。12周齡雄性C57Bl/6J小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Control)、運(yùn)動(dòng)性心肌肥大組(Swim)、假手術(shù)組(Sham)、病理性心肌肥大組(TAC)，每組10只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用二維超聲心動(dòng)圖檢測(cè)室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)和心功能。對(duì)心肌組織蛋白采用Western Blot檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)水平，衡量心肌細(xì)胞增殖能力。采用RT-PCR、Western Blot和免疫組化的方法檢測(cè)心肌細(xì)胞中CBP的表達(dá)水平。為驗(yàn)證CBP對(duì)心肌細(xì)胞增殖能力的激活作用，在離體實(shí)驗(yàn)中，以去氧腎上腺素(PE)誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥大，采用CBP抑制劑C646抑制CBP表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)分組情況：1)對(duì)照組(Control)；2)PE組；3)C646組；4)PE+C646組。對(duì)心肌細(xì)胞爬片進(jìn)行α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞大小，免疫熒光檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原Ki67的表達(dá)衡量心肌細(xì)胞增殖水平，RT-PCR檢測(cè)CBP的mRNA水平。結(jié)果：1)游泳運(yùn)動(dòng)和TAC均能使小鼠產(chǎn)生明顯的心肌肥大，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，兩種心肌肥大模型的IVS、LVPW、左室容量(LV Vol)和射血分?jǐn)?shù)(EF)都有明顯升高(P<0.05)。2)Swim組小鼠心肌組織PCNA蛋白表達(dá)水平明顯高于Control組(P<0.05)和TAC組(P<0.01)。3)Swim組心肌組織CBP的mRNA水平比Control組明顯升高(P<0.01)，且明顯高于TAC組(P<0.05)。Swim組心肌組織CBP蛋白表達(dá)水平與Control組相比有明顯升高(P<0.05)，且顯著高于TAC組(P<0.01)，TAC組比Sham組明顯降低(P<0.05)。心肌組織切片CBP的免疫組化結(jié)果顯示，Swim組CBP陽(yáng)性細(xì)胞顯著多于Control組(P<0.01)與TAC組(P<0.01)。4)離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PE組心肌細(xì)胞面積顯著高于Control組(P<0.05)和PE+C646組(P<0.05)。PE能使CBP的mRNA表達(dá)水平比Control組明顯升高(P<0.01)，PE+C646組CBP的mRNA水平比PE組明顯降低(P<0.01)。PE組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞與Control組相比明顯增多(P<0.01)，PE+C646組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞與PE組相比明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)能明顯激活心肌細(xì)胞的增殖能力，并伴隨著CBP的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，抑制CBP的表達(dá)水平可以抑制心肌細(xì)胞的增殖能力，提示，CBP在有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

有氧運(yùn)動(dòng)；心肌肥大；心肌細(xì)胞增殖；CBP

心肌肥大是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生率和死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，是心力衰竭的前驅(qū)病變。運(yùn)動(dòng)性心肌肥大是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中的普遍生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞、血管、間質(zhì)成比例地增生，側(cè)枝循環(huán)大量建立，有效地緩解了心肌肥大可能引發(fā)的相對(duì)缺血，維護(hù)了心臟的泵血功能[6,19]。因此，心肌細(xì)胞的增殖能力是決定心肌肥大發(fā)展轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的重要因素，尋找心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控因素，對(duì)于減少心力衰竭和心臟破裂猝死的風(fēng)險(xiǎn)，保障人們生命健康具有十分重要的意義。

運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響一直受到人們的關(guān)注。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以導(dǎo)致心肌肥大和心臟收縮能力加強(qiáng)，泵血功能增加。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，大鼠心梗手術(shù)后5周進(jìn)行游泳或跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，可減輕左心室擴(kuò)張，非梗死區(qū)室壁發(fā)生適應(yīng)性肥大，梗死面積縮小。運(yùn)動(dòng)還可誘導(dǎo)高血壓大鼠心肌大量祖細(xì)胞趨向分化[13]。可見(jiàn)，運(yùn)動(dòng)對(duì)成體心肌細(xì)胞的再生、增殖具有促進(jìn)作用，但其具體的機(jī)制和信號(hào)通路，目前還不是很清楚。因此，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用和關(guān)鍵調(diào)控分子，可為臨床缺血性心肌疾病的治療和康復(fù)運(yùn)動(dòng)提供理論依據(jù)和策略方法。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic-AMP-responsive element binding protein,CREB)是核內(nèi)刺激基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)因子，CREB只有和CREB綁定蛋白(CREB-bingding protein,CBP)結(jié)合成復(fù)合物后，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能，因此CBP又被稱(chēng)為CREB的輔助激活因子[17]。目前發(fā)現(xiàn)，CBP能與多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和維持穩(wěn)態(tài)等活動(dòng)密切相關(guān)[14,15,20]。本研究主要觀察運(yùn)動(dòng)性和病理性心肌肥大在心肌細(xì)胞增殖方面的表型差異，并探討了CBP在心肌細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性C57Bl/6J小鼠，12周齡，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物比較中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK蘇2012-0029)。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Control)，運(yùn)動(dòng)性心肌肥大組(Swim)，假手術(shù)組(Sham)，病理性心肌肥大組(TAC)，每組10只。飼養(yǎng)溫度25℃±2℃，自然采光，分組分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)性心肌肥大組進(jìn)行游泳耐力訓(xùn)練，游泳池體積為60 cm×40 cm×60 cm，水深為40 cm，水溫為31℃～34℃。正式訓(xùn)練前9天為適應(yīng)階段，從第1天的10 min逐漸增加到第9天的90 min。正式訓(xùn)練時(shí)每天上、下午各1次，每次持續(xù)訓(xùn)練90 min，維持此強(qiáng)度訓(xùn)練2周。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3 病理性心肌肥大模型構(gòu)建

病理性心肌肥大組小鼠進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)(transverse aortic constriction,TAC)構(gòu)建。TAC手術(shù)操作要點(diǎn)如下[2，11]：采用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)氣管插管與嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)連接。經(jīng)頸部正中切口向下暴露主動(dòng)脈弓部，在左頸總動(dòng)脈與頭臂干之間血管下方穿一個(gè)7-0號(hào)絲線(xiàn)，并緊貼血管放置一個(gè)26號(hào)針頭，用絲線(xiàn)將動(dòng)脈與針頭一起扎緊并迅速抽出針頭，按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)造成不完全縮窄，術(shù)后飼養(yǎng)2周。假手術(shù)組小鼠行開(kāi)胸手術(shù)暴露主動(dòng)脈弓但不進(jìn)行動(dòng)脈縮窄，進(jìn)行縫合術(shù)后飼養(yǎng)2周。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

主要儀器有小動(dòng)物高頻彩色超聲系統(tǒng)(General Electric Co.,Fairfield,Conn)，動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V8)，冷凍切片機(jī)(LEICA)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,IX51)，低溫高速離心機(jī)(Eppendrof)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems 7500)，電泳儀和轉(zhuǎn)移槽(BioRad)，凝膠掃描成像系統(tǒng)(UVP,GDS-8000)等。主要試劑包括：抗CBP、PCNA、Lamin A、GAPDH一抗，購(gòu)自Santa Cruz公司和康成生物；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master (ROX)試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；PE、C646購(gòu)自Sigma公司。

1.5 二維超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

小鼠腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉后，脫毛固定四肢于操作臺(tái)上。取左室長(zhǎng)軸切面二尖瓣水平，在第4肋間探及，探頭頻率為13 MHz，掃描速度100 mm/s，在二維超聲引導(dǎo)下取M超聲曲線(xiàn)。觀測(cè)指標(biāo)：心臟室間隔厚度(interventricular septum dimension,IVS)、左室后壁厚度(LV posterior wall dimension,LVPW)、左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fractional shortening,EF)和左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)等心功能指標(biāo)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)

充分研磨心肌組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物由Invitrogen公司合成，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為SYBR Green (ROX) 10 μl，上、下游引物共0.6 μl，cDNA 100 ng，DEPC水加至總體積20 μl，充分混勻。PCR反應(yīng)條件為：50℃預(yù)處理2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。ABI 7500軟件記錄數(shù)據(jù)并分析，將目的基因的Ct值與內(nèi)參GAPDH的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表 1 本研究目的基因引物序列

1.7 Western Blot實(shí)驗(yàn)

采用蛋白提取液分別抽提胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。等量蛋白采用8% SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫?fù)u動(dòng)封閉(5%脫脂牛奶)1 h。分別加入鼠抗CBP(1∶200)，兔抗PCNA(1∶200)，兔抗Lamin(1∶200)，鼠抗GAPDH(1∶1 000)多克隆抗體。4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下洗膜后加入相應(yīng)二抗孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光底物ECL(Promega)進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.8 乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取2～4天的SD乳鼠心臟，置于DMEM培養(yǎng)基中，充分剪碎，加入0.08% 胰酶2 ml，37℃水浴震蕩，多次消化收集上清，至無(wú)明顯顆粒。所有上清經(jīng)1 000 rpm，離心10 min。棄上清，沉淀用300 μl DEME重懸，反復(fù)吹打，即為細(xì)胞懸液。經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后，計(jì)數(shù)并分別接種于6孔板和24孔板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分為4組：1)Control組，不做任何處理，細(xì)胞正常培養(yǎng)；2)PE組，給予去氧腎上腺素(Phenylephrine,PE)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和增殖(10 μM)，處理24 h；3)C646組，加入CBP抑制劑C646(30 μM)抑制CBP的表達(dá)，處理30 min后換正常培養(yǎng)基；4)PE+C646組，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入C646處理30 min后，換正常培養(yǎng)液，加PE處理24 h。收取4組心肌細(xì)胞，進(jìn)行心肌細(xì)胞免疫熒光及提取心肌細(xì)胞總RNA。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 兩種心肌肥大模型心室壁厚度和心功能結(jié)果比較

二維超聲心動(dòng)圖詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，心超結(jié)果提示，兩種造模方法都能使小鼠心肌產(chǎn)生肥厚。Swim組和TAC組小鼠收縮期和舒張期IVS和LVPW與相應(yīng)的對(duì)照組相比都有明顯增加(P<0.05)。Swim組LVIDs，收縮期、舒張期LV Vol比Control組明顯減小(P<0.05)，TAC組收縮期、舒張期LVID、LV Vol與Sham組相比都有明顯減小(P<0.05)。Swim組和TAC組EF和FS與相應(yīng)的對(duì)照組相比，都有明顯升高(P<0.05)。提示，兩種心肌肥大模型尚處于向心性肥大階段，因此心室內(nèi)徑減小，心功能尚處于代償期，甚至有所升高。

表 2 二維超聲心動(dòng)圖檢查的各項(xiàng)數(shù)據(jù)

注：a表示與Control組比較，P<0.05；b表示與Sham組比較，P<0.05，n=10。IVSd：舒張期室間隔厚度；IVSs：收縮期室間隔厚度；LVPWd：舒張期左室后壁厚度；LVPWs：收縮期左室后壁厚度；LVIDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVIDs：左室收縮末期內(nèi)徑； LV Vol d：左室舒張末期容積；LV Vol s：左室收縮末期容積；EF：射血分?jǐn)?shù)；FS：縮短分?jǐn)?shù)。

2.1.2 兩種心肌肥大模型心肌細(xì)胞增殖程度比較

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear autigen,PCNA)存在于細(xì)胞核內(nèi)，是DNA合成和復(fù)制所必須的輔助因子，也是細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志。采用Western blot方法檢測(cè)各組小鼠心肌組織PCNA的蛋白表達(dá)水平。如圖1所示，Swim組和TAC組小鼠心肌組織PCNA表達(dá)水平分別較Control組(P<0.01)和Sham組(P<0.05)顯著增高，其中Swim組升高更為明顯，與TAC組比較也有顯著性差異(P<0.05)。提示，Swim和TAC均可以使小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生一定程度的增殖，但有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞地增殖具有更為明顯的激活作用。

圖 1 各組小鼠心肌組織PCNA表達(dá)水平示意圖

2.1.3 兩種心肌肥大模型心肌組織CBP的表達(dá)差異

對(duì)心肌組織冰凍切片進(jìn)行CBP的免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖2A、2B)，與Control組相比，Swim組小鼠心肌CBP陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)，TAC組的CBP陽(yáng)性細(xì)胞與相應(yīng)對(duì)照組相比沒(méi)有明顯改變。Swim組心肌組織CBP陽(yáng)性細(xì)胞比TAC組顯著增多(P<0.01)。

對(duì)各組小鼠心肌組織總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)CBP的表達(dá)水平(圖2C)，結(jié)果可見(jiàn)，與Control組相比，Swim組小鼠心肌組織CBP的mRNA水平顯著升高(P<0.01)；而TAC組與Sham組相比，CBP的mRNA水平有輕微增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。Swim組和TAC組相比，CBP的mRNA水平有顯著性差異(P<0.05)。

采用Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織胞核的CBP蛋白表達(dá)水平。如圖2D和2E所示，Swim組與Control組相比，小鼠心肌組織中CBP表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；TAC組較Sham組，CBP表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。而Swim組與TAC組相比，CBP表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.01)。

2.2 離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 各組心肌細(xì)胞肥大程度比較

離體實(shí)驗(yàn)采用給予PE誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥大，以CBP的抑制劑C646抑制CBP的表達(dá)。PE能在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥大和增殖[10,16]，C646是新發(fā)現(xiàn)的抑制CBP的小分子化學(xué)抑制劑，能減少CBP表達(dá)，抑制其乙?；傅幕钚訹8]。對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(α-actin)，檢測(cè)心肌細(xì)胞面積，以此衡量心肌細(xì)胞肥大程度。如圖3A、3B所示，PE能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，PE處理組與Control組相比，心肌細(xì)胞面積增大明顯(P<0.05)。而C646能明顯抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，PE+C646組與PE組比較，心肌細(xì)胞面積明顯減小(P<0.05)；只使用C646的C646組小鼠，其心肌細(xì)胞面積與PE比較也有顯著減小(P<0.01)。

圖 2 各組小鼠心肌組織CBP的表達(dá)水平示意圖

圖 3 離體實(shí)驗(yàn)各組心肌細(xì)胞肥大程度示意圖

2.2.2 各組心肌細(xì)胞CBP的mRNA表達(dá)水平比較

由圖4可見(jiàn)，與Control組相比，PE組心肌細(xì)胞CBP的mRNA水平顯著升高(P<0.01)；C646組較Control組有輕微上調(diào)，但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢?jiàn),C646處理能顯著降低PE引起的CBP的mRNA水平上升(P<0.01)，這與各組心肌細(xì)胞肥大的趨勢(shì)相吻合。

圖 4 離體實(shí)驗(yàn)各組心肌細(xì)胞CBP的mRNA表達(dá)水平示意圖

2.2.3 各組心肌細(xì)胞增殖程度比較

Ki67是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，Ki67的表達(dá)水平可作為衡量細(xì)胞增殖的標(biāo)志性指標(biāo)。如圖5A、5B所示，PE組與Control組相比，Ki67表達(dá)陽(yáng)性的心肌細(xì)胞顯著增多(P<0.01)；PE+C646組，Ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞與PE組相比顯著減少(P<0.05)。提示，CBP的表達(dá)水平受到抑制，能下調(diào)心肌細(xì)胞的肥大和增殖。

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)性和病理性心肌肥大在表型方面的差異分析

心肌肥大是心臟對(duì)外界刺激的一種結(jié)構(gòu)代償性反應(yīng)，分為運(yùn)動(dòng)性和病理性?xún)煞N。二者在發(fā)病機(jī)制、疾病轉(zhuǎn)歸、預(yù)后等方面都存在諸多差異。在心肌肥大的發(fā)病機(jī)制中，心肌細(xì)胞的增殖尤為重要。心肌細(xì)胞增殖可以改善心肌的舒縮功能，有效防止心腔擴(kuò)大和心力衰竭。本研究以游泳運(yùn)動(dòng)構(gòu)建運(yùn)動(dòng)性心肌肥大模型，用TAC法構(gòu)建病理性心肌肥大模型，探討運(yùn)動(dòng)性和病理性心肌肥大在心肌細(xì)胞增殖上的差別及調(diào)控因子。

圖 5 離體實(shí)驗(yàn)各組心肌細(xì)胞增殖程度示意圖

研究表明，游泳運(yùn)動(dòng)和TAC法都能使小鼠左室室壁和室間隔增厚，提示，兩種方法都能誘導(dǎo)小鼠心肌產(chǎn)生肥大，其中病理性心肌肥大模型更為明顯，而LVIDd和LVIDs下降，提示，兩種心肌肥大模型都處于早期，心室肌增厚明顯，出現(xiàn)向心性肥大，心室內(nèi)徑略有下降，射血分?jǐn)?shù)略有升高，心功能都處于代償期。病理性心肌肥大早期，因?yàn)樾氖冶诜屎衩黠@，心室內(nèi)徑減小，左心室舒張末期容積顯著減少，每搏輸出量減少，但EF值不降反升。而到了病理性心肌肥大后期，由于大量心肌細(xì)胞凋亡壞死，心室腔擴(kuò)大，心肌舒縮乏力，EF值才會(huì)出現(xiàn)明顯降低。所以，在評(píng)定心臟泵血功能時(shí)，不能單純考慮每搏輸出量和射血分?jǐn)?shù)，心臟的舒張功能也很重要。有研究表明，病理性心肌肥大中心臟功能變化主要表現(xiàn)為舒張功能降低[4]。進(jìn)而使心室充盈不足，從而嚴(yán)重影響心臟的泵血功能。

在研究中也發(fā)現(xiàn)[2]，運(yùn)動(dòng)性心肌肥大模型心肌組織只有少量膠原纖維沉積，而病理性心肌肥大模型膠原纖維大量沉積，且大都堆積于血管周?chē)Ｓ斡具\(yùn)動(dòng)使心肌中胚胎型基因心鈉肽(attrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的mRNA表達(dá)水平僅有輕微增加，而病理性心肌肥大小鼠心肌中ANP、BNP的mRNA表達(dá)水平顯著增加。

綜上，游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)都能誘導(dǎo)小鼠心臟出現(xiàn)明顯的肥大，且二者的肥大程度沒(méi)有明顯差異。有氧訓(xùn)練誘導(dǎo)的心肌肥大沒(méi)有明顯的缺氧和損傷情況，但病理性心肌肥大具有較為嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化改變和心肌組織缺氧。

3.2 運(yùn)動(dòng)性和病理性心肌肥大在心肌細(xì)胞增殖方面的差異分析

一直以來(lái)，成體心肌細(xì)胞被認(rèn)為是終末分化細(xì)胞，不再有增殖能力，細(xì)胞數(shù)目不會(huì)增加。但正常生理和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下心肌細(xì)胞也有死亡和凋亡，心肌細(xì)胞數(shù)量卻沒(méi)有減少，提示，心肌細(xì)胞有一定的增殖能力，使心肌細(xì)胞數(shù)量處于動(dòng)態(tài)平衡。隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)，心肌組織中仍有部分心肌細(xì)胞處于有絲分裂期，缺血性心肌病患者處于有絲分裂期的細(xì)胞數(shù)量會(huì)大為增加[3,7]。Waring等[18]的研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠的肥大心肌細(xì)胞(體積>40 cm3)數(shù)量多于安靜對(duì)照組，且運(yùn)動(dòng)組新生心肌細(xì)胞(體積<10 cm3)的細(xì)胞數(shù)量也多于安靜對(duì)照組，說(shuō)明，有氧運(yùn)動(dòng)不僅促進(jìn)了大鼠心肌細(xì)胞肥大，且誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞地增殖。本研究結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌組織PCNA蛋白表達(dá)顯著增高，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)使心肌細(xì)胞的增殖明顯激活。雖然運(yùn)動(dòng)性和病理性心肌肥大模型心肌PCNA的蛋白表達(dá)均有所升高，但上升幅度存在明顯差異。其可能的原因是病理性心肌肥大模型的心肌細(xì)胞缺血、缺氧，能量代謝紊亂，心肌細(xì)胞增殖功能被部分激活，但不是很明顯；而有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞的增殖功能激活明顯，抑制間質(zhì)增生，減緩心室重構(gòu)過(guò)程，使心臟舒縮功能增強(qiáng)，維持了心臟泵血功能。

3.3 CBP在有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖能力中的作用

CREB是心肌細(xì)胞增殖通路IGF-1/Akt下游一個(gè)核內(nèi)刺激基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)因子，其結(jié)合蛋白CBP最早作為一種與CREB結(jié)合的核蛋白被分離出來(lái)，CBP的KIX域與磷酸化的CREB的KID域相互作用形成復(fù)合物后，CREB才能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，CBP能與多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，對(duì)骨骼、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌等地增殖、再生過(guò)程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[9，14,17]。曾維政等[5]研究認(rèn)為，CBP是將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵分子，TGF-β可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)膠原蛋白合成。肝組織中的CBP可以引起膠原蛋白合成、肝細(xì)胞增生、肝小葉重建。

CBP對(duì)心肌細(xì)胞的影響也有報(bào)道。Gusterson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PE誘導(dǎo)新生乳鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生肥大的過(guò)程中， CBP和p300這一對(duì)轉(zhuǎn)錄的共激活物被激活。構(gòu)建反義引物或顯性負(fù)性突變可以明顯抑制PE誘導(dǎo)的心肌肥大。心肌細(xì)胞表現(xiàn)為蛋白合成減少，DNA率和細(xì)胞大小均減小。過(guò)表達(dá)CBP或p300時(shí)則可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。因此，在PE誘導(dǎo)的心肌肥大中，CBP和p300承擔(dān)著至關(guān)重要的作用，這種作用是通過(guò)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)介導(dǎo)的。陳國(guó)珍等[1]研究表明，CBP在胚胎小鼠心臟發(fā)育階段高表達(dá)，在心臟的發(fā)生發(fā)育中發(fā)揮重要作用。但CBP對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響，目前仍沒(méi)有定論。

本研究結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)性心肌肥大小鼠心肌中CBP 的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，且心肌細(xì)胞的增殖功能被明顯激活。而在病理性心肌肥大中CBP的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，心肌細(xì)胞增殖也不明顯，提示，CBP的表達(dá)水平與心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖之間存在某種關(guān)聯(lián)。

為進(jìn)一步探討CBP的表達(dá)水平與心肌細(xì)胞增殖能力之間的關(guān)系，本研究利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞采用PE誘導(dǎo)細(xì)胞肥大和增殖激活，發(fā)現(xiàn)其CBP的mRNA水平顯著升高，細(xì)胞增殖功能也明顯激活。而給予CBP的抑制劑C646處理后，心肌細(xì)胞CBP的mRNA水平明顯受到抑制，心肌細(xì)胞面積減小，增殖能力也受到明顯抑制，說(shuō)明，CBP的表達(dá)水平對(duì)心肌肥大和心肌細(xì)胞增殖確實(shí)起到了關(guān)鍵性作用。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)性心肌肥大發(fā)生過(guò)程中，有氧運(yùn)動(dòng)能促使CBP表達(dá)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、肥大，使心肌組織收縮能力加強(qiáng)，心功能明顯改善。抑制CBP的表達(dá)水平后，可以抑制心肌細(xì)胞的增殖和肥大。對(duì)于缺血性心肌疾病的病人，建議適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)或采用內(nèi)源性激活CBP的方法，使心肌細(xì)胞的增殖功能激活，起到減緩心室重構(gòu)，保護(hù)心功能的作用，這將成為新的治療思路和靶點(diǎn)。

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Effect of Aerobic Exercise on Cardiomyocyte Proliferation and Regulation of CBP

HU Yu-long1,XU Hui1,2,LIU Yan-qiu3,LI Ning-chuan1,CHEN Zhi-jun1,ZAN Xiao1

Objective:To explore the effect of aerobic exercise on the activation of cardiomyocyte proliferation in cardiac hypertrophy and the role of cyclic-AMP-responsive element binding protein binding protein (CBP) in it by in vivo and in vitro experiments.Method:The exercise-induced cardiac hypertrophy model was made by swim training for 2 wks,and the pathological model was made by transverse aortic constriction (TAC) for 2 wks.12-week-old C57Bl/6J mice were divided randomly into control group,swim group,sham group and transverse aortic constriction (TAC) group.By the end of experiments,cardiac hypertrophy,contractility were evaluated by echocardiography.The expression level of myocardial proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were examined by Western Blot to evaluate the degree of cardiomyocytes proliferation.The expression level of myocardial CBP were examined by RT-PCR,Western Blot and immunohistochemical methods.To verify the effect of CBP on activation of cardiomyocytes proliferation,we did in vitro experiment on primary cardiomyocytes.In this experiment,cardiomyocyte hypertrophy was induced by phenylephrine (PE),and C646 was used to inhibit the expression of CBP.The primary cardiomyocytes were divided randomly into 4 groups in vitro,control,PE,C646 and PE+C646 groups.Meanwhile,cardiomyocyte hypertrophy was detected by α-actin immunofluorescence,CBP mRNA expression was detected by RT-PCR,and the expression level of Ki67 was detected by immunofluorescence to evaluate the degree of cardiomyocytes proliferation.Results:1) Compared with corresponding control groups,inter ventricular septum thickness (IVS),left ventricular posterior wall thickness (LVPW),left ventricle volume (LV Vol) and ejection factor (EF) of exercise-induced and pathological cardiac hypertrophy models were significantly increased (P<0.05).2) The protein expression level of PCNA in swim group was higher than that of control group (P<0.05) and TAC group (P<0.01).3) CBP mRNA expression of swim group was increased significantly than that of control (P<0.01) and TAC group (P<0.05).CBP protein expression of TAC was decreased significantly than that of Sham (P<0.05),and the level of swim were higher obviously than those of control (P<0.05) and TAC (P<0.01).The immunohistochemistry of CBP showed that CBP-positive cells of Swim was significantly more than Control (P<0.01) and TAC group (P<0.01).4) The results of in vitro experiment were that primary cardiomyocytes performance hypertrophy induced by PE (P<0.05),and use of C646 could decrease cardiomyocyte hypertrophy (P<0.05) significangtly than that of PE.CBP mRNA expression of PE was significantly increased compared with Control (P<0.05),and this level was obviously inhibited by C646 (P<0.01).The immunofluorescence of Ki67 showed that PE could increase Ki67-positive cells obviously (P<0.01),and cardiomyocytes proliferation were inhibited (P<0.05) when CBP activity were suppressed.Conclusion:Aerobic exercise could promote myocardial proliferation through activating CBP.Cardiomyocytes proliferation was inhibited when CBP activity were suppressed.CBP plays an important role in the process of aerobic exercise promote cardiomyocytes proliferation.

aerobicexercise;cardiachypertrophy;cardiomyocyteproliferation;CBP

1002-9826(2016)05-0052-07

10.16470/j.csst.201605008

2015-07-18；

2016-06-01

胡玉龍(1975-)，女，湖南臨武人，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)對(duì)心血管疾病的干預(yù)機(jī)制，Tel：(0514)87997109，E-mail：ylhu@yzu.edu.cn。

1.揚(yáng)州大學(xué) 體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127； 2.鎮(zhèn)江市體育科研所，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3.揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225001 1.Yangzhou University,Yangzhou 225127,China;2.Zhenjiang Research Institute of Sport Science,Zhenjiang 212000,China;3.Yangzhou First People’s Hospital,Yangzhou 225001,China.

G804.2

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