唐凱 周新妹 吳長(zhǎng)明 陳群 陳濤 王彩平

血漿D-乳酸對(duì)非甾體抗炎藥相關(guān)腸黏膜損害的早期診斷探討

唐凱 周新妹 吳長(zhǎng)明 陳群 陳濤 王彩平

目的探討NSAIDs引起小腸黏膜損傷的機(jī)制，D-乳酸作為血漿標(biāo)志物應(yīng)用于NSAIDs腸黏膜損害的早期診斷價(jià)值。方法 雄性大鼠40只，對(duì)照組20只，對(duì)照組灌胃2 ml蒸餾水，2次/d；模型組阿司匹林片50mg/kg，2次/d，分T1（2d給藥）和T2（7d給藥）亞組，各10只。實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行小腸黏膜病理?yè)p傷評(píng)分；分析緊密連接Occludin蛋白的表達(dá)；同步測(cè)定血漿D-乳酸值。結(jié)果（1）模型組呈小腸黏膜損傷病理改變，T2亞組病理評(píng)分明顯高于T1亞組（P＜0.01）。（2）Occludin/ GAPDH相對(duì)密度值模型組均較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin/GAPDH相對(duì)密度值顯著低于T1亞組（t=7.646，P＜0.01）。（3）同步測(cè)定模型組血漿D-乳酸與對(duì)照組比較均明顯升高（P＜0.01），T2亞組血漿D-乳酸較T1亞組明顯升高（t=67.773，P＜0.01）。結(jié)論阿司匹林可導(dǎo)致大鼠小腸黏膜屏障破壞；測(cè)定血漿D-乳酸可以較早的反映NSAIDs引起的小腸黏膜損害。

血漿D-乳酸 非甾體抗炎藥 Occludin蛋白 小腸損傷

非甾體類抗炎藥（NSAIDs）具有良好的抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛作用，廣泛用于關(guān)節(jié)炎及緩解疼痛癥狀，在心腦血管病預(yù)防也是基礎(chǔ)用藥之一。臨床重視NSAIDs引起的胃黏膜損害，而導(dǎo)致小腸潰瘍、出血、穿孔、腸通透性升高的副作用的發(fā)生率高、風(fēng)險(xiǎn)大，近年逐漸受到臨床關(guān)注［1］。2014年2月至2015年10月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討NSAIDs引起小腸黏膜損傷的機(jī)制，了解其病理生理變化，設(shè)立早期篩查指標(biāo)，在發(fā)生腸并發(fā)癥之前，能夠?yàn)镹SAIDs服用者提供一個(gè)便捷、可靠的非侵入性檢查方法，達(dá)到防止嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生的目的。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠40只，180～220g。由嘉興醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；阿司匹林腸溶片為德國(guó)拜耳制藥公司產(chǎn)品，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)抽簽法，將40只大鼠隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組20只，模型組20只，每組再進(jìn)一步隨機(jī)分為2d給藥和7d給藥亞組，各10只，模型組分別標(biāo)注為T1亞組、T2亞組。

1.3 給藥方法 對(duì)照組以2ml蒸餾水灌胃，2次/d；模型組以阿司匹林片50mg/kg灌胃，2次/d。2d給藥對(duì)照組和T1亞組大鼠在灌胃2d后處死，7d給藥對(duì)照組和T2亞組大鼠在灌胃7d后處死。

1.4 標(biāo)本制作 大鼠禁食、不禁水12h，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用10%水合氯醛3ml/kg劑量腹腔注射麻醉后處死；肉眼觀測(cè)小腸黏膜標(biāo)本損傷狀況。取頸靜脈血10ml，離心后取血漿分裝，-80℃保存，用于D-乳酸的測(cè)定；在距回盲部25cm取小腸1cm，置10%甲醛液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。

1.5 小腸黏膜上皮損傷程度組織病理評(píng)分 采用Chiu氏評(píng)分法分級(jí)［2］，O級(jí)：正常腸黏膜絨毛。Ⅰ級(jí)：腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬。Ⅱ級(jí)：中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張。Ⅲ級(jí)：腸黏膜上皮層細(xì)胞壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落。Ⅳ級(jí)：部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細(xì)血管充血。Ⅴ級(jí)：固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.6 Occludin蛋白檢測(cè) 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）法檢測(cè)Occludin蛋白，按照說(shuō)明書進(jìn)行SP三步法進(jìn)行免疫組化染色，Occludin陽(yáng)性呈棕黃色顆粒狀，主要定位于小腸上皮細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)。WesternBlot檢測(cè)Occludin蛋白表達(dá)：取各組大鼠小腸組織，加入組織裂解液，勻漿后離心，取上清液，測(cè)定蛋白含量；經(jīng)過(guò)凝膠蛋白電泳，光化學(xué)法顯色，拍片，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照，利用QuantiScan凝膠圖像掃描分析軟件測(cè)定電泳條帶的光密度值，計(jì)算Occludin與GAPDH光密度的比值。

1.7 血漿D-乳酸濃度測(cè)定（分光光度法） 按照試劑盒說(shuō)明書操作，計(jì)算大鼠血漿D-乳酸濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜O.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸大體標(biāo)本變化 對(duì)照組腸道黏膜光滑，腸管彈性好。T1亞組大鼠小腸黏膜可見(jiàn)散在淺表糜爛、潰瘍；T2亞組大鼠腸黏膜見(jiàn)多發(fā)潰瘍?cè)?，部分有出血?/p>

2.2 光鏡下觀察結(jié)果 對(duì)照組小腸黏膜無(wú)明顯改變，絨毛完整無(wú)脫落。T1亞組腸絨毛腫脹、增粗、縮短，部分頂端破損；T2亞組小腸黏膜明顯萎縮，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)上皮細(xì)胞變性壞死、脫落，部分絨毛斷裂、脫落，固有層裸露。模型組病理評(píng)分均高于對(duì)照組（P＜O.01），T2亞組病理評(píng)分明顯高于T1亞組（P＜0.01），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組大鼠小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn)（HE，×100）

表1 對(duì)照組和模型組大鼠小腸黏膜病理評(píng)分（x±s）

2.3 各組Occludin蛋白表達(dá) 經(jīng)過(guò)免疫組化染色的病理切片顯示，對(duì)照組小腸黏膜胞膜及胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)明顯Occludin蛋白表達(dá)，表現(xiàn)為較多棕黃色細(xì)顆粒聚集；T1亞組及T2亞組較對(duì)照組均有減少，T2亞組減少更明顯。腸黏膜緊密連接Occludin蛋白的表達(dá)：Occludin/ GAPDH相對(duì)密度值T1亞組（0.507±0.051）和T2亞組（0.644±0.026）均較對(duì)照組（1.264±0.016）明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin/GAPDH對(duì)密度值顯著低于T1組（t=7.646，P＜0.01），見(jiàn)圖2～4。

圖2 各組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞Occludin蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠腸黏膜Occludin蛋白電泳結(jié)果（Western blot法）

2.4 血漿D乳酸檢測(cè)結(jié)果T1、T2亞組血漿D乳酸與對(duì)照組比較均明顯升高（P＜0.01），T2亞組血漿D乳酸較T1亞組明顯升高（t=67.773，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 分組大鼠D-乳酸值比較（x±s）

圖4 各組大鼠腸上皮緊密連接occludin蛋白表達(dá)的不同

3 討論

NSAIDs是具鎮(zhèn)痛及抗炎作用的藥物，廣泛應(yīng)用于各種急慢性疼痛及風(fēng)濕性心血管類疾病，每年大約有20萬(wàn)使用NSAIDs患者出現(xiàn)并發(fā)癥，病死率＞10%［3］。既往對(duì)NSAIDs的消化道損傷重點(diǎn)多關(guān)注在胃黏膜，但NSAIDs引起的腸道副作用的發(fā)生率高、風(fēng)險(xiǎn)大，近年逐漸受到臨床關(guān)注；NSAIDs所致的小腸黏膜早期病變多數(shù)為表淺性小潰瘍，潰瘍面與周圍黏膜界限清晰［4］，還可出現(xiàn)小腸出血、蛋白質(zhì)丟失性腸病、腸通透性升高及穿孔等，統(tǒng)稱為NSAIDs相關(guān)性腸病。本資料中參照成人用阿司匹林劑量作用大鼠腸道，結(jié)果大鼠小腸黏膜有不同程度的糜爛、潰瘍等病變發(fā)生，光鏡下也有相應(yīng)的病理改變。

目前NSAIDs導(dǎo)致腸道損害的可能機(jī)制中，炎性反應(yīng)起關(guān)鍵作用，通過(guò)抑制環(huán)氧合酶活性過(guò)程中增加白三烯的生成，促進(jìn)組胺、自由基釋放，造成腸道黏膜損傷［5］；腸道屏障破壞，通透性增加使小腸細(xì)胞暴露在膽汁、消化酶及細(xì)菌機(jī)會(huì)明顯增加，導(dǎo)致腸黏膜損傷［6］。腸黏膜機(jī)械屏障由腸道黏液層、上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接等構(gòu)成，是阻止致病物質(zhì)入侵及細(xì)菌移位的屏障系統(tǒng)［7］，其功能的發(fā)揮需要完整的上皮細(xì)胞屏障，Occludin作為一種整體膜蛋白，是細(xì)胞間緊密連接的重要組成部分，對(duì)維持腸道上皮屏障的完整至關(guān)重要［8］。本資料中對(duì)照組大鼠小腸上皮Occludin蛋白密集表達(dá)，T1亞組及T2亞組較對(duì)照組分布均有減少，T2亞組減少更明顯；Occludin/ GAPDH相對(duì)密度值模型組均較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin /GAPDH相對(duì)密度值顯著低于T1組（P＜0.01）。提示模型組大鼠腸道黏膜機(jī)械屏障遭到破壞，隨病程延長(zhǎng)破壞加重。

在此實(shí)驗(yàn)，腸黏膜屏障狀況采用了新的血漿標(biāo)志物D-乳酸定量測(cè)評(píng)。一般認(rèn)為，D-乳酸是細(xì)菌代謝產(chǎn)物，腸道中多種細(xì)菌均可產(chǎn)生；當(dāng)腸黏膜屏障受損，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的D-乳酸通過(guò)受損黏膜入血循環(huán)，哺乳動(dòng)物缺乏D-乳酸脫氫酶，當(dāng)腸黏膜受損早期、腸黏膜通透性增加時(shí)，血中可檢測(cè)到D-乳酸水平升高［9］。本資料中，T2亞組光鏡下腸黏膜受損更明顯，同步檢測(cè)D-乳酸水平較T1亞組明顯升高，表明D-乳酸測(cè)定較好的反映大鼠腸黏膜的受損狀況，T1亞組較對(duì)照組D-乳酸顯著升高，可早期提示大鼠腸黏膜的損害，表明血漿D-乳酸水平變化與NSAIDs引起的小腸黏膜進(jìn)行性受損相關(guān)。因此，通過(guò)靜脈血檢測(cè)D-乳酸水平可反映NSAIDs所致腸黏膜損害的程度。

總之，NSAIDs可導(dǎo)致腸黏膜破壞，體循環(huán)D-乳酸水平相應(yīng)升高，其含量與小腸黏膜損害相關(guān)。因此，D-乳酸可作為血漿標(biāo)志物應(yīng)用于NSAIDs腸黏膜損害的早期診斷。對(duì)于長(zhǎng)期服用NSAIDs的患者，可進(jìn)行血檢測(cè)D-乳酸篩查，發(fā)現(xiàn)數(shù)值升高者，再考慮安排侵入性的內(nèi)鏡檢查。NSAID的小腸損害機(jī)制尚不明確，本資料中大鼠腸黏膜occludin蛋白表達(dá)減少，反映腸道屏障的破壞是機(jī)制之一，其他途徑尚需進(jìn)一步研究。

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ObjectiveTo study the mechanism of NSAIDs induced intestinal mucosal injury，and the early diagnosis of D-lactate as a marker of NSAIDs in the early diagnosis of intestinal mucosal damage.Methods40 male rats，the control group of 20，the control to fi ll the stomach 2 ml distilled water twice a day；Model group aspirin 50 mg/Kg twice a day，points T1（2 day delivery）and T2 for 7 days（medicine）subgroups，10 each. After the experiment of small intestinal mucosa pathological damage score；analyze the changes of Occludin protein localizing at tight junction of intestinal epithelial cells；Simultaneous determination of D-lactate in plasma.ResultsIn the model group，the pathological changes of intestinal mucosa injury，the pathological score of T2 subgroup was signifi cantly higher than that in T1（P＜0.01）；（2）The relative density of Occludin/ GAPDH was signifi cantly lower than that in control group（P＜0.01），and the relative density of Occludin/GAPDH in T2 subgroup was signifi cantly lower than that in T1（t=7.646，P＜0.01）；（3）In the model group，the plasma D-lactate was signifi cantly higher than that in the control group（P＜0.01），and the D-lactate in the T2 subgroup was signifi cantly higher than that in the T1（t=67.773，P＜0.01）.ConclusionAspirin can cause intestinal mucosal barrier damage in rats；the plasma D-lactate can refl ect the NSAIDs induced intestinal mucosal lesion in the early.

The Plasma D-lactate NSAIDs Occludin Protein Intestinal Damage

浙江省嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014AY21035-3）

314000 浙江省榮軍醫(yī)院（唐凱 吳長(zhǎng)明 陳群 陳濤王彩平）

314000 浙江省嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院（周新妹）