莊 華,成玉林,康振生

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥條銹菌泛肽-核糖體蛋白S27a基因的鑒定與表達(dá)分析

莊 華1,成玉林2,康振生1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定到一個(gè)泛肽-核糖體蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因，命名為PsUBRS27a。該基因開放閱讀框?yàn)?80 bp，編碼包含159個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27結(jié)構(gòu)域；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)UBRS27a蛋白在不同物種中高度保守，但PsUBRS27a蛋白在進(jìn)化上與柄銹菌屬的UBRS27a蛋白親緣關(guān)系最近；種內(nèi)多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)PsUBRS27a基因在不同小麥條銹菌菌系中的序列非常保守，無核苷酸變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，PsUBRS27a基因在條銹菌侵染小麥過程中呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，高峰期為接種后168 h。關(guān)鍵詞 泛肽-核糖體蛋白S27a；PsUBRS27a；小麥條銹菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；表達(dá)譜

泛肽-核糖體蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a, UBRPS27a)是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，其N和C端分別含有一個(gè)ubiquitin(UB)結(jié)構(gòu)域和Ribosomal_S27結(jié)構(gòu)域，且兩端結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守[1]。在細(xì)胞中, UB的常見功能是參與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的選擇性降解, 而核糖體蛋白的常見功能是組裝成核糖體, 主導(dǎo)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。越來越多的證據(jù)表明, 許多種核糖體蛋白除組成核糖體、參與蛋白質(zhì)生物合成之外, 還具有其他功能，如參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄加工、修復(fù)、自體翻譯、細(xì)胞凋亡調(diào)控、以及正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)育調(diào)控等[2-3]。然而，目前對(duì)UB和核糖體蛋白在植物病原菌中的作用了解很少。

由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一種重要真菌病害。生產(chǎn)上主要利用抗病品種來防治小麥條銹病，但由于小麥抗病品種容易隨著條銹菌致病性的不斷變異而喪失抗性，導(dǎo)致條銹病持續(xù)威脅著全球小麥生產(chǎn)和糧食安全。因此，解析小麥條銹菌的致病及其變異機(jī)制對(duì)開發(fā)新的持久防治小麥條銹病策略具有重要意義[4]。

小麥條銹菌屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)中的柄銹菌屬(Puccinia)。它屬于嚴(yán)格的活體營養(yǎng)型病原菌，只能于活的寄主植物上獲得營養(yǎng)，進(jìn)行繁殖和完成生活史。和其他銹菌一樣，小麥條銹菌在侵染過程中能夠形成高度特化的侵染結(jié)構(gòu)-吸器，通過吸器與寄主植物進(jìn)行信息和能量的交流，對(duì)銹菌的致病性起著關(guān)鍵作用。利用親和層析法可將銹菌吸器從侵染植物中分離開來，之后將分離得到的吸器進(jìn)行測(cè)序鑒定到銹菌吸器cDNA文庫[5-8]，而其中的一些基因被證實(shí)為銹菌關(guān)鍵的致病相關(guān)基因[9-10]。

本試驗(yàn)從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定到一個(gè)泛肽-核糖體蛋白S27a基因，并對(duì)該基因的序列和轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征進(jìn)行分析，明確該基因?yàn)楹蜻x的小麥條銹菌致病基因。研究結(jié)果為今后深入探究UBRS27a蛋白在小麥條銹菌致病性中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料，菌種以及培養(yǎng)條件

供試小麥品種為“水源11”，種植于10 cm的花盆中，放置于16 ℃溫室，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。小麥條銹菌菌系包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD，在感病小麥品種“銘賢169”上隔離繁殖。

所用的大腸桿菌菌株JM109由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫研究室提供，用LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。

小麥條銹菌的接種與繁殖：首先用毛筆涂抹接種法[11]將新鮮的條銹菌夏孢子接種于小麥葉片；接著將接種植株放置于16 ℃黑暗保濕箱保濕24 h；之后將保濕過的接種植株移至16 ℃溫室培養(yǎng)14 d后就可開始收集新鮮夏孢子。

1.2 儀器與試劑

Gel DocTMXR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)和SW-CY-2FB 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)等常用儀器。

Biozol試劑(BioFluxTM)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)，TransStart FastPfu DNA Polymerase (全式金公司)，TaqDNA polymerase (Thermo)，膠回收試劑盒(BioTeke)，pMD19-T Simple (Takara)，pGEM-T Easy(Promega)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒(OMEGA)等常用試劑。

1.3 RNA樣品的采集

為了明確基因在小麥條銹菌不同侵染階段的表達(dá)特征，選取新鮮夏孢子、萌發(fā)夏孢子以及接種小麥后的一系列時(shí)間取樣，每個(gè)樣品用錫箔紙包好，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，備用。采用Biozol 試劑(BioFlux)提取樣品的RNA，第一鏈cDNA 的合成按照Invitrogen 公司的M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒操作說明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄引物采用oligod(T)18。

1.4 序列分析及比對(duì)

蛋白的保守結(jié)構(gòu)域用Pfam(http://pfam.xfam.org/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。其他物種的同源蛋白通過Blastp在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。進(jìn)化樹分析用MEGA5(http://www.megasoftware.net)軟件，多序列用DNAMAN軟件比對(duì)。

1.5 種內(nèi)多態(tài)性分析

為了分析基因的種內(nèi)序列多態(tài)性，比較其在7個(gè)不同小麥條銹菌菌系中的編碼區(qū)(ORF)序列，包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD。通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序來得到該基因在這7個(gè)小麥條銹菌菌系中的序列。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

根據(jù)PsUBRS27a的 cDNA 序列，利用Primer Preimer 5.0 設(shè)計(jì)特異的定量PCR 引物，并選用小麥條銹菌的延伸因子(elongation factor，EF)作為內(nèi)參(表 1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照Guo等[12]方法。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用Delta Delta Ct 法[13]分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 文中所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 PsUBRS27a基因的基本特征

在己構(gòu)建的小麥條銹菌吸器cDNA文庫[8]中獲得一個(gè)編碼潛在UBRPS27a蛋白的cDNA序列-PSTha15J12(GenBank number：GH737195.1)。將該cDNA序列于Broad Institute中的小麥條銹菌基因組(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group/ Blast.html)中Blastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該cDNA所對(duì)應(yīng)的小麥條銹菌基因號(hào)為PSTG_01817.1。通過PCR 克隆驗(yàn)證，獲得該基因序列全長，與數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的序列一致，命名為PsUBRS27a。PsUBRS27a的開放閱讀框?yàn)?80 bp，編碼包含159個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27結(jié)構(gòu)域(圖1)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種的UBRS27a蛋白相似度非常高，達(dá)85%以上。然而，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PsUBRS27a蛋白在進(jìn)化上與柄銹菌屬的UBRS27a蛋白親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖1 PsUBRS27a蛋白的結(jié)構(gòu)特征

圖2 不同物種UBRS27a蛋白的進(jìn)化樹分析

2.2PsUBRS27a基因的種內(nèi)多態(tài)性分析

為了鑒定PsUBRS27a基因的種內(nèi)序列多態(tài)性，在7個(gè)不同的小麥條銹菌菌系(CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD)中比較它的編碼區(qū)序列。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)PsUBRS27a基因在不同小麥條銹菌菌系中的序列非常保守，無核苷酸變化。

2.3PsUBRS27a基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征

接下來用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來明確PsUBRS27a基因在小麥條銹菌不同侵染階段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征。和夏孢子階段相比，PsUBRS27a在條銹菌侵染小麥階段呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其高峰期為接種后168 h(圖3)。這些結(jié)果表明PsUBRS27a基因在條銹菌侵染寄主小麥中誘導(dǎo)表達(dá)，因此有可能對(duì)小麥條銹菌的侵染和致病性具有貢獻(xiàn)。

3 討 論

泛肽-核糖體蛋白S27a是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，跟蛋白質(zhì)的合成與選擇性降解密切相關(guān)，然而目前關(guān)于植物病原菌泛肽-核糖體蛋白S27a的研究是一個(gè)空白。在本試驗(yàn)中，通過對(duì)小麥條銹菌泛肽-核糖體蛋白S27a基因進(jìn)行研究，證實(shí)泛肽-核糖體蛋白可能在小麥條銹菌致病性中起著重要作用，這填補(bǔ)了植物病原真菌關(guān)于泛肽-核糖體蛋白S27a研究的空白，為今后揭示泛肽-核糖體蛋白S27a在病菌致病性中的作用奠定基礎(chǔ)。

U.夏孢子 Urediniospores；GU.萌發(fā)夏孢子 Germinated urediniospores；18 h～216 h.接種CYR32后18 h～216 h的小麥樣品 18 hours-216 hours post inoculation with CYR32 in wheat; 數(shù)值代表3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 Values are the average ± SD of three independent experiments.

本研究證實(shí)UBRS27a蛋白在不同物種中序列高度保守，之前也有類似文獻(xiàn)報(bào)道[14]。然而UBRS27a蛋白在不同物種中的功能是否高度保守目前不是很清楚。另外，PsUBRS27a基因被證實(shí)在不同小麥條銹菌菌系中序列非常保守，無核苷酸變化。種間和種內(nèi)序列的高度保守性揭示UBRS27a蛋白在不同生物體(包括小麥條銹菌)中的重要作用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，PsUBRS27a基因在條銹菌侵染寄主小麥中誘導(dǎo)表達(dá)，且誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)很高，最高可達(dá)50倍。這表明PsUBRS27a是一個(gè)候選的小麥條銹菌致病基因，對(duì)小麥條銹菌的侵染和致病性具有重要貢獻(xiàn)?？紤]到PsUBRS27a從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定，且PsUBRS27a的表達(dá)高峰期為接種后168 h，而該時(shí)期小麥條銹菌吸器大量形成，因此推測(cè)PsUBRS27a可能是通過影響吸器發(fā)育或功能從而參與小麥條銹菌的侵染和致病性。

今后，將通過多種方法來揭示PsUBRS27a基因在小麥條銹菌致病性中的具體作用，并深入探究其分子作用機(jī)制，這為最終解析小麥條銹菌的致病機(jī)制，及開發(fā)新的持久防治小麥條銹病策略，具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Identification and Expression Analysis of an Ubiquitin-ribosomal Protein S27a Gene fromPucciniastriiformisf.sp.tritici

ZHUANG Hua1，CHENG Yulin2and KANG Zhensheng1

(1. College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling Shaanxi 712100, China；2. College of Life Sciences, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100, China)

We identified an ubiquitin-ribosomal protein S27a gene (designatedPsUBRS27a) from the cDNA library of isolated haustoria ofPucciniastriiformisf. sp.tritici(Pst).PsUBRS27ahas an open reading frame of 480 bp that encodes a 159 aa protein whose N terminal and C terminal contain a ubiquitin domain and a ribosomal_S27 domain, respectively. Further sequence alignment revealed thatPsUBRS27aproteins are highly conserved in different organisms, but phylogenetic analysis indicated that thePsUBRS27aprotein is more closely related to UBRS27a proteins fromPucciniagroup. The intra-species polymorphism ofPsUBRS27awas studied and the results indicated thatPsUBRS27awas highly conserved in different Pst isolates and no single-nucleotide polymorphism was observed. qRT-PCR analysis showed that transcript level ofPsUBRS27awas induced in planta during Pst infection and was peaked at 168 hour post-inoculation. This study provides important theoretical basis for further studying of the role of UBRS27a in Pst pathogenicity.

Ubiquitin-ribosomal protein S27a;PsUBRS27a;Pucciniastriiformisf. sp.tritici; qRT-PCR; Expression profile

ZHUANG Hua, female,technician.Research area:immunology.E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

KANG Zhensheng, male,professor.Research area:immunology.E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

2016-08-16

2016-10-09

國家“973”計(jì)劃(2013CB127700)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃“111”(B07049)。

莊 華，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锩庖邔W(xué)。E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

康振生，男，教授，從事植物免疫學(xué)研究。E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.010.html

S432.1

A

1004-1389(2016)12-1775-05

Received 2016-08-16 Returned 2016-10-09

Foundation item National “973” program(No.2013CB127700)；the “111 ” Project from the Ministry of Education of China (No.B07049).