雷 明，李志英，王加賓,喬 飛，徐 立

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571737)

蜻蜓鳳梨 AfERF113基因的克隆與表達(dá)特性

雷 明，李志英，王加賓,喬 飛，徐 立

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南儋州 571737)

觀賞鳳梨是一類重要的熱帶花卉，但有關(guān)其生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控分子機(jī)理的研究相對(duì)匱乏，這在一定程度上限制了新品種的開(kāi)發(fā)和利用。以熱帶觀賞花卉蜻蜓鳳梨(Aechemiafasciata)為材料，在分析蜻蜓鳳梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆了APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，并將其命名為AfERF113。生物信息學(xué)分析表明，AfERF113cDNA全長(zhǎng)1 093 bp，有1個(gè)864 bp的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼287個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，該蛋白分子質(zhì)量為29.768 5 ku，理論等電點(diǎn)為6.06，為一類不穩(wěn)定的酸性親水蛋白。亞細(xì)胞定位軟件預(yù)測(cè)表明該蛋白定位于細(xì)胞核。結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白有1個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，分屬ERF亞族的B-4類，與擬南芥中所有ERF蛋白的ERF113親源關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)結(jié)果表明，AfERF113轉(zhuǎn)錄本在成熟株的根中表達(dá)量最高，且外源乙烯誘導(dǎo)后，AfERF113的表達(dá)量無(wú)論是在幼株還是在成株的各組織中均顯著上調(diào)。研究結(jié)果證實(shí)，AfERF113響應(yīng)了外源乙烯調(diào)控，為進(jìn)一步研究AfERF113基因的功能及通過(guò)基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論依據(jù)。

蜻蜓鳳梨；AP2/EREBP家族；AfERF113；乙烯；表達(dá)分析

鳳梨科(Bromeliaceae)植物原產(chǎn)于南美，包括58個(gè)屬3 248個(gè)種，是一類廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)形態(tài)最為多樣的種屬之一[1-2]。鳳梨科植物的一些品種如食用鳳梨(菠蘿Ananascomosus)在6 000多年前就已經(jīng)被馴化[3-4]。除了菠蘿外，人工栽培的鳳梨科植物還包括一類重要的熱帶花卉，即觀賞鳳梨。觀賞鳳梨進(jìn)入人們的生活不過(guò)百余年歷史，傳入中國(guó)則在20世紀(jì)90年代中期，但因其形態(tài)多樣、花期持久，市場(chǎng)發(fā)展突飛猛進(jìn)，現(xiàn)已成為僅次于蘭花和紅掌的第3大熱帶花卉，效益超過(guò)了菠蘿[5]。

作為一種重要的植物激素，乙烯參與種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、開(kāi)花誘導(dǎo)、果實(shí)成熟、器官衰老和病原菌響應(yīng)等植物生長(zhǎng)發(fā)育的諸多過(guò)程，是植物體應(yīng)答很多生物和非生物脅迫的關(guān)鍵因子[6-7]。擬南芥中，目前已知響應(yīng)乙烯信號(hào)的受體蛋白有5個(gè)，分別為ETHYLENE RESPONSE1(ETR1)、ETR2、ETHYLENE RESPONSE SENSOR1(ERS1)、ERS2和ETHYLENEINSENSITIVE4(EIN4)[8-9]。乙烯受體蛋白結(jié)合乙烯后抑制了Raf-like Ser/Thr 蛋白酶 CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1(CTR1)的磷酸化能力，使得膜蛋白ETHYLENE INSENSITIVE2(EIN2)被激活[10-11]?；罨腅IN2穩(wěn)定了轉(zhuǎn)錄因子EIN3在核內(nèi)的表達(dá)，EIN3蛋白則通過(guò)結(jié)合到ERFs基因(如ERF1)的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控后者的表達(dá)，最終啟動(dòng)了植物對(duì)各種信號(hào)的應(yīng)答響應(yīng)[12]。

ERFs屬于APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族。依據(jù)所含AP2結(jié)構(gòu)域以及序列同源性的差異，AP2/EREBP家族又可以分為5個(gè)亞族：AP2亞族、干旱響應(yīng)元件結(jié)合蛋白亞族(Dehydration Responsive Element Binding Protein，DREB)、乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白亞族ERF、Related to ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3)/VIVIPAROUS1 (VP1)(RAV)亞族以及其他蛋白類[13]。其中，ERF亞族含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)及同源性分析結(jié)果，ERF亞族蛋白可以分為B-1到B-6共6類，這6類大部分都是轉(zhuǎn)錄激活因子，但有些含有ERF相關(guān)雙親抑制(ERF-associated amphiphilic repression ，EAR)基序的B-1類蛋白則是轉(zhuǎn)錄抑制因子[14-19]。ERFs轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)結(jié)合到靶標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)的核心AGCCGCC(GCC box)順式元件上調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，應(yīng)答細(xì)菌、真菌或病毒病原體等造成的生物脅迫[20-22]，也有一些ERFs可以通過(guò)識(shí)別干旱響應(yīng)元件(dehydration-responsive elements，DREs/CRT)應(yīng)答非生物脅迫[23]。另外，一些ERFs轉(zhuǎn)錄因子則可以同時(shí)識(shí)別GCC box和DREs/CRT元件調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)[24]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)鳳梨科植物AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的研究很少。Lei等[25]報(bào)道了蜻蜓鳳梨(Aechemiafasciata)中的1個(gè)AP2亞族的基因AfAP2-1的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)響應(yīng)了外源乙烯處理，且在擬南芥中過(guò)表達(dá)顯著延遲了開(kāi)花。前期研究中，通過(guò)乙烯處理和未處理的蜻蜓鳳梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析發(fā)現(xiàn)，1個(gè)AP2家族的基因在乙烯處理24 h后的蜻蜓鳳梨成株心葉中表達(dá)量顯著上升(未發(fā)表)，基于此，通過(guò)RACE技術(shù)克隆該基因的全長(zhǎng)，并將其命名為AfERF113。此外，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析解析其組織表達(dá)特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其的確受外源乙烯處理的調(diào)控。研究為進(jìn)一步解析AfERF113基因響應(yīng)外源乙烯或其他脅迫因素的分子機(jī)制及通過(guò)基因工程手段調(diào)控鳳梨科植物生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

蜻蜓鳳梨取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所離體保存與繁育研究室大棚，環(huán)境溫度為30～32 ℃。所用材料均為移栽成活的試管苗，幼株為成活后株齡6個(gè)月植株；成株為成活后株齡11～14個(gè)月的植株。外源乙烯利處理時(shí)，取10 mL體積分?jǐn)?shù)為400 μL·L-1的乙烯利灌心，分別處理1、6、24 h，以清水灌心的材料為對(duì)照。不同組織材料在處理后迅速于液氮中冷凍，之后置于-80 ℃保存，備用。

1.2 總RNA提取及cDNA第1條鏈的合成

蜻蜓鳳梨總RNA的提取采用改良的CTAB法[26]。cDNA第1條鏈的合成采用TranScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(Transgene)，具體過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 5′和3′ RACE

前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得了414 bp的基因片段。為了獲得該基因的全長(zhǎng)，首先參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的說(shuō)明書(shū)合成了5′和3′ RACE模板。根據(jù)已有的414 bp的序列，分別設(shè)計(jì)了5′和3′特異引物進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。其中，5′的外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物分別為5′ RACE GSP51和5′ RACE GSP52，3′的外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物分別為3′ RACE GSP31和3′ RACE GSP32。引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增得到的特異性條帶采用OMEGA(Omega)的膠回收試劑盒進(jìn)行。純化后的特異條帶分別連接到pEASY-blunt克隆載體上，測(cè)序。測(cè)序后的條帶與轉(zhuǎn)錄組序列拼接后再做進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)分析；利用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸和氨基酸的序列比對(duì)與分析；利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)；利用MEGA 6.0軟件和鄰接法進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；利用ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性及穩(wěn)定性；利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Cell-PLoc package(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/)、WOLF Psort(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)和ProtComp(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl& group=programs&subgroup=proloc)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；利用Phyre2軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

運(yùn)用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的各基因特異引物。選用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Transgene)進(jìn)行PCR反應(yīng)，在Therma PikoReal 96TM熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)上進(jìn)行。反應(yīng)體系(10 μL)：qRT-PCR混合反應(yīng)液SuperMix 5 μL，模板1 μL，正反向引物各0.3 μL，滅菌的去離子水補(bǔ)齊至10 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性7 min，然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s的條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后65 ℃ 30 s，20 ℃停止。每個(gè)樣品2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用雙delta法，選取蜻蜓鳳梨的β-actin(AfACTB)為內(nèi)參。通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。所有引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1AfERF113cDNA全長(zhǎng)的克隆與序列分析

以蜻蜓鳳梨心葉cDNA為模板，利用RACE及PCR技術(shù)獲得1條長(zhǎng)度為1 093 bp的AP2/EREBP家族基因的cDNA序列。分析后發(fā)現(xiàn)，其5′非編碼區(qū)(5′ untranscriptional region，5′-UTR)長(zhǎng)度為114 bp，3′非編碼區(qū)(3′ untranscriptional region，3′-UTR)長(zhǎng)度為115 bp(包括25 bp的polyA)，開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)長(zhǎng)度為864 bp，編碼287個(gè)氨基酸殘基。將其在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與很多植物中AP2/EREBP家族ERF亞族的ERF113或ERF113-like基因具有很高的相似性，故將其命名為AfERF113(Genbank登錄號(hào)：KX371269)。

2.2 AfERF113蛋白的同源性和進(jìn)化樹(shù)分析

序列比對(duì)分析表明，AfERF113與油棕(Elaeisguineensis)的ERF113、海棗(Phoenixdactylifera)的ERF113、荷花(Nelumbonucifera)的ERF113和小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)的ERF114分別具有51.92%、48.43%、40.46%和39.57%的同源性(圖1)。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，AfERF113具有1個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域，包含保守的YPG和RAYD元件(圖1)。此外，該保守的AP2結(jié)構(gòu)域的第14位和第19位氨基酸殘基分別為丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)(圖1)，因此，AfERF113屬于AP2/EREBP家族的ERF亞族。

為了進(jìn)一步分析AfERF113在ERF亞族中的類別，將其與擬南芥(Arabidopsisthaliana)ERF亞族B1～B6類別中的部分蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AfERF113與擬南芥的ERF112、ERF113、ERF114、ERF115等進(jìn)化關(guān)系最近，同屬于B4類(圖2)。

2.3AfERF113的理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)

利用ProtoParam在線軟件分析AfERF113后發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29.768 5 ku，理論等電點(diǎn)為6.06，總平均親水性(GRAVY)為-0.460，不穩(wěn)定系數(shù)為60.51，因此推測(cè)AfERF113是一類不穩(wěn)定的酸性親水蛋白。利用TMHMM在線軟件對(duì)AfERF113進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)為0.003 62，遠(yuǎn)小于18；此外，N端60個(gè)氨基酸殘基中位于跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)為0.000 82，遠(yuǎn)小于10，推測(cè)該蛋白不含跨膜區(qū)(圖3-A)，這與ProtoParam預(yù)測(cè)其為親水性蛋白的結(jié)果一致。進(jìn)一步使用SignalP 4.1在線軟件對(duì)AfERF113進(jìn)行了信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白的N端70個(gè)氨基酸殘基中并不含信號(hào)肽(圖3-B)，推測(cè)該蛋白不屬于分泌蛋白。為了驗(yàn)證該蛋白的亞細(xì)胞定位，分別使用Cell-PLoc package、WOLF Psort和ProtComp軟件分析對(duì)其進(jìn)行分析。3個(gè)不同的軟件分析結(jié)果都預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核，且ProtComp軟件預(yù)測(cè)其為轉(zhuǎn)錄因子。

表1 本研究所用的引物

AfERF113. 蜻蜓鳳梨(Aechemia fasciata) ERF113；EgERF113.油棕(Elaeis guineensis)ERF113，XP_010929690.1；NnER113.荷花(Nelumbo nucifera)ERF113，XP_010249458.1；MaERF114. 小果野芭蕉(Musa acuminata subsp.)ERF114，XP_009405112.1；PdERF113.海棗(Phoenix dactylifera)ERF113，XP_008791015.1

圖2 AfERF113的分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

A.AfERF113的信號(hào)肽分析 The analysis of signal peptide of AfERF113；B.AfERF113的跨膜區(qū)分析 The analysis of transmembrane region of AfERF113

為了更進(jìn)一步明晰AfERF113蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用Phyre2軟件對(duì)其進(jìn)行三維建模。以擬南芥ERF1蛋白(PDB ID：1gcc.1.C)為模板，獲得AfERF113蛋白保守結(jié)構(gòu)域91-152 氨基酸肽段區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)模型(圖4-A，4-B)。從該模型中可以看到， AfERF113的該保守結(jié)構(gòu)域主要含有3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋，其中2個(gè)β折疊由一級(jí)結(jié)構(gòu)中的YPG元件構(gòu)成，另一個(gè)β折疊和α螺旋主要由RAYD元件構(gòu)成，這與很多ERF蛋白核心區(qū)域的構(gòu)象類似，表明該模擬構(gòu)象合理，空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

A.二級(jí)結(jié)構(gòu) The second structure；B.三維模型 The three-dimension structure

2.4 AfERF113的組織表達(dá)特性

為了研究AfERF113在蜻蜓鳳梨各組織中的表達(dá)特性，分別選取幼株、成株和抽薹39 d后成株的外葉、心葉、莖和根，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，AfERF113轉(zhuǎn)錄本在幼株各組織以及未開(kāi)花的成熟株和抽薹39 d后的成熟株的外葉、心葉和莖中的表達(dá)量相對(duì)較低，但在未開(kāi)花的成熟株和抽薹39 d后的成熟株根中表達(dá)量則顯著升高(圖5-A)。此外，AfERF113轉(zhuǎn)錄本在花器官中的表達(dá)量均很低(圖5-B)。

2.5AfERF113對(duì)外源乙烯處理的響應(yīng)特性

為了驗(yàn)證AfERF113對(duì)外源乙烯處理的響應(yīng)情況，分別用10 mL體積分?jǐn)?shù)為400 μL·L-1的乙烯利對(duì)蜻蜓鳳梨幼株和成株的整株進(jìn)行灌心處理，然后于處理后的1、6、24 h分別對(duì)幼株和成株的外葉、心葉、莖和根中AfERF113轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在幼株中，乙烯處理1 h后AfERF113在各檢測(cè)組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖6-A)；在成株中，乙烯處理1 h后AfERF113在外葉和心葉中的表達(dá)量上調(diào)顯著，在莖中的表達(dá)量則隨著外源乙烯處理時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)步上升，而在根中的表達(dá)量則在乙烯處理后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖6-B)。這些結(jié)果表明，在蜻蜓鳳梨的幼株和成株中，AfERF113在不同的組織中可能具有不盡相同的功能。

A. AfERF113在蜻蜓鳳梨幼株、成株和抽薹39 d后的成株各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 in variable tissues of juvenile plants, adult plants before flowering, and 39-day after flowering (DAF) adult plants；B. AfERF113在抽薹39 d后的成株?duì)I養(yǎng)器官和生殖器官中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 in vegetative and reproductive organs of 39-DAF adult plants

A. AfERF113在乙烯處理后幼株各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of juvenile plants treated with ethylene；B. AfERF113在乙烯處理后成株各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of adult plants treated with ethylene

A. AfERF113在乙烯處理后幼株各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of juvenile plants treated with ethylene；B. AfERF113在乙烯處理后成株各組織中的相對(duì)表達(dá)量 Relative expression of AfERF113 transcripts in variable tissues of adult plants treated with ethylene

3 討 論

自從AP2轉(zhuǎn)錄因子和ERFBP轉(zhuǎn)錄因子分別首次于1994年和1995年從擬南芥和煙草中被分離鑒定出以來(lái)[20, 27]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物、原生生物、藍(lán)藻和真菌中[28-29]。本研究首次從重要的熱帶花卉蜻蜓鳳梨中克隆到AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子ERF亞族的一個(gè)基因，根據(jù)BLAST同源比對(duì)結(jié)果，將其命名為AfERF113。

AfERF113具有一個(gè)非常典型的AP2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在一級(jí)結(jié)構(gòu)上含有2個(gè)特別保守的氨基酸序列(圖1-A, 1-B)。其中，YPG元件在二級(jí)結(jié)構(gòu)上可以形成2個(gè)β折疊，RAYD元件可以形成1個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋(圖4)。在模擬的三級(jí)結(jié)構(gòu)上， AfERF113的AP2結(jié)構(gòu)域與擬南芥的ERF1(PDB ID：1gcc.1.C)非常相似(圖4)。已知這3個(gè)反向平行的β折疊在幫助AP2結(jié)構(gòu)域識(shí)別各種順式作用元件中可能起重要作用[30]，而兩親性的α螺旋則參與了DNA或其他轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用[31]。此外， AfERF113的AP2結(jié)構(gòu)域中第14位和第19位分別是保守的丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)，區(qū)別于大部分DREB家族的纈氨酸(Val14，V14)和谷氨酸(Glu19，E19)[13]。 AfERF113在蛋白結(jié)構(gòu)上的保守性暗示其在功能上也可能具有一些保守性。

3.1 AfERF113的轉(zhuǎn)錄本具有組織表達(dá)特異性

基因表達(dá)模式的分析是進(jìn)一步研究生物學(xué)功能的基礎(chǔ)[32]。研究結(jié)果顯示，ERF113同源基因在不同物種中的組織特異性表達(dá)既有共性，又有差別。擬南芥的ERF113(RAP2.6L)在成熟干燥的種子、花(尤其是雄蕊)、子葉下胚軸、成熟的根以及發(fā)育中的木質(zhì)部均高表達(dá)[33-34]；楊樹(shù)(Populus)的一個(gè)RAP2.6L同源基因則在雌雄花、木質(zhì)部和根中有強(qiáng)表達(dá)[35]；黑胡桃(JuglansnigraL.)的一個(gè)RAP2.6L同源基因JnRAP2-like則在雌花中表達(dá)量最高，而在根中其次，在雄花中則檢測(cè)不到其表達(dá)[36]。本研究結(jié)果顯示，在蜻蜓鳳梨幼株的外葉、心葉、莖和根中，AfERF113的表達(dá)量均較低(圖5-A)。但是隨著植株年齡的增長(zhǎng)，AfERF113在成株根中的表達(dá)量顯著上升，為幼株根中表達(dá)量的126倍(圖5-B)，這暗示AfERF113可能調(diào)控蜻蜓鳳梨根的生長(zhǎng)發(fā)育。另外，AfERF113在蜻蜓鳳梨花器官中的表達(dá)量均維持在相對(duì)較低的水平，與擬南芥、楊樹(shù)和黑胡桃的RAP2.6L同源基因的表達(dá)模式不盡相同，說(shuō)明蜻蜓鳳梨中的AfERF113可能進(jìn)化出新的功能。

3.2AfERF113轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)響應(yīng)了外源乙烯處理

植物生長(zhǎng)發(fā)育同時(shí)受外源環(huán)境信號(hào)和內(nèi)源信號(hào)的調(diào)控，其中，重要的內(nèi)源信號(hào)則包括植物激素，比如乙烯[37]。乙烯進(jìn)化為植物激素已有4.5億年的歷史[38]。乙烯調(diào)控了種子發(fā)育、幼苗生長(zhǎng)、葉子和花瓣的脫落、果實(shí)成熟、器官衰老和病蟲(chóng)害響應(yīng)等多種植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，很多物種的ERF113及其同源基因響應(yīng)了乙烯處理。擬南芥RAP2.6L轉(zhuǎn)錄本在乙烯處理6～24 h逐漸上升，過(guò)表達(dá)RAP2.6L的擬南芥植株提高了對(duì)乙烯處理的抗性[39]。柑橘(Citrus)的一個(gè)RAP2.6L同源基因在乙烯調(diào)控的葉片衰老中上調(diào)[40]。黑胡桃的JnRAP2.6-like在擬南芥中過(guò)表達(dá)后參與了木質(zhì)部等組織中乙烯和茉莉酸協(xié)同調(diào)控路徑[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯利處理1 h后，蜻蜓鳳梨幼株各組織中AfERF113的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量均顯著上升(圖6-A)；成株中，外葉、心葉和莖中AfERF113的轉(zhuǎn)錄本達(dá)到最大表達(dá)量所用的時(shí)間分別為1、6、24 h，而在根中的表達(dá)量則在處理24 h后下調(diào)了(圖6-B)。AfERF113在幼株和成株各組織中受外源乙烯處理誘導(dǎo)表達(dá)的差異性表明：首先，蜻蜓鳳梨的株齡影響了乙烯對(duì)AfERF113的調(diào)控；其次，組織特異性造成AfERF113的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量受乙烯誘導(dǎo)后達(dá)到最大值時(shí)出現(xiàn)了時(shí)間差。已知ERF家族中擬南芥的ERF1在轉(zhuǎn)錄水平上直接受乙烯信號(hào)路徑的EIN3調(diào)控[12]，因此，通過(guò)克隆AfERF113的基因組和啟動(dòng)子序列，找到并驗(yàn)證是否存在乙烯響應(yīng)元件，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)外方法尋找不同組織中與AfERF113DNA或蛋白發(fā)生相互作用的因子，有望為更好地解析AfERF113在不同株齡及不同組織中對(duì)乙烯誘導(dǎo)響應(yīng)差異的機(jī)制。

已知擬南芥的RAP2.6L參與了從根外植體再生出芽的調(diào)控[41]、病害防疫[42]及髓細(xì)胞分化和器官再生[43]。未來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)基因結(jié)合高低溫脅迫、鹽脅迫及其他激素脅迫處理的方法進(jìn)一步探究AfERF113基因在蜻蜓鳳梨生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中的基本功能，無(wú)疑可以為通過(guò)基因工程手段調(diào)控蜻蜓鳳梨乃至鳳梨科植物生長(zhǎng)發(fā)育提供理論依據(jù)。

Reference：

[1] LUTHER H E.An Alphabetical List of Bromeliad Binomials[M].Florida:The Bromeliad Society International,2010:4.

[2] VERSIEUX L M,BARBARA T,WANDERLEY M,etal.Molecular phylogenetics of the Brazilian giant bromeliads(Alcantarea,Bromeliaceae):implications for morphological evolution and biogeography [J].MolecularPhylogeneticEvolution,2012,64(1):177-189.

[3] CLEMENT C R,DE CRISTO-ARAJO M,dEECKENBRUGGE G C,etal.Origin and domestication of native amazonian crops[J].Diversity,2010,2(1):72-106.

[4] MING R,VAN BUREN R,WAI C M,etal.The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis [J].NatureGenetics,2015,47(12):1435-1442.

[5] 李志英.鳳梨科植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2014:1.

LI ZH Y.Tissue Culture Technology of Bromeliads [M].Beijing:Chinese Agricultural Press,2014:1(in Chinese).

[6] MLLER M,MUNN-BOSCH S.Ethylene response factors:a key regulatory hub in hormone and stress signaling [J].PlantPhysiology,2015,169:32-41.

[7] SHAKEEL S N,GAO Z,AMIR M,etal.Ethylene regulates levels of ethylene receptor-CTR1 signaling complexes inArabidopsisthaliana[J].JournalofBiologicalChemistry,2015,290(19):12415-12424.

[8] BLEECKER A B.Ethylene perception and signaling:an evolutionary perspective [J].TrendsinPlantScience,1999,4(7):269-274.

[9] CHANG C,STADLER R.Ethylene hormone receptor action inArabidopsis[J].BioEssays:NewsandReviewsinMolecular,CellularandDevelopmentalBiology,2001,23(7):619-627.

[10] KKEBER J J,ROTHENBERG M,ROMAN G,etal.CTR1,a negative regulator of the ethylene response pathway inArabidopsis,encodes a member of the raf family of protein kinases [J].Cell,1993,72(3):427-441.

[11] ALONSO J M,HIRAYAMA T,ROMAN G,etal.EIN2,a bifunctional transducer of ethylene and stress responses inArabidopsis[J].Science,1999,284(5423):2148-2152.

[12] SOLANO R,STEPANOVA A,Chao Q,etal.Nuclear events in ethylene signaling:a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 [J].Genes&Development,1998,12(23):3703-3714.

[13] SAKUMA Y,LIU Q,DUBOUZET J G,etal.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain ofArabidopsisDREBs,transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression [J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2002,290(3):998-1009.

[14] FUJIMOTO S Y,OHTA M,USUI A,etal.Arabidopsisethylene-responsive element binding factors act as transcriptional activators or repressors of GCC box-mediated gene expression [J].ThePlantCell,2000,12:393-404.

[15] OHTA M,MATSUI K,HIRATSU K,etal.Repression domains of class II ERF transcriptional repressors share an essential motif for active repression [J].ThePlantCell,2001,13(8):1959-1968.

[16] SONG C P,AGARWAL M,OHTA M,etal.Role of anArabidopsisAP2/EREBP-type transcriptional repressor in abscisic acid and drought stress responses [J].ThePlantCell,2005,17(8):2384-2396.

[17] ZHANG G,CHEN M,CHEN X,etal.Isolation and characterization of a novel EAR-motif-containing gene GmERF4 from soybean(GlycinemaxL.) [J].MolecularBiologyReports,2009,37(2):809-818.

[18] ZHANG G,CHEN M,LI L,etal.Overexpression of the soybeanGmERF3gene,an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt,drought,and diseases in transgenic tobacco [J].JournalofExperimentalBotany,2009,60(13):3781-3796.

[19] ZHAI Y,LI J W,LI X W,etal.Isolation and characterization of a novel transcriptional repressor GmERF6 from soybean [J].BiologiaPlantarum,2012,57(1):26-32.

[20] OHME-TAKAGI M,SHINSHI H.Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element [J].ThePlantCell,1995(7):173-182.

[21] YI S Y,KIM J H,JOUNG Y H,etal.The pepper transcription factor CaPF1 confers pathogen and freezing tolerance inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2004,136(1):2862-2874.

[22] ZUO K J,QIN J,ZHAO J Y,LING H,etal.Over-expression GbERF2 transcription factor in tobacco enhances brown spots disease resistance by activating expression of downstream genes [J].Gene,2007,391(1/2):80-90.

[23] MCGRATH K C.Repressor and activator-type ethylene response factors functioning in jasmonate signaling and disease resistance identified via a genome-wide screen ofArabidopsistranscription factor gene expression [J].PlantPhysiology,2005,139(2):949-959.

[24] CHENG M C,LIAO P M,KUO W W,etal.TheArabidopsisETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals [J].PlantPhysiology,2013,162(3):1566-1582.

[25] LEI M,LI Z Y,WANG J B,etal.AfAP2-1,an age-dependent gene ofAechmeafasciata,responds to exogenous ethylene treatment [J].InternationalJournalofMolecularSciences,2016,17(3):303.

[26] 叢漢卿,信彩云,張銀東,等.‘阿蒂晴天’鳳梨谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與乙烯誘導(dǎo)表達(dá)特性的初步分析[J].分子植物育種,2013,11(3):365-370.

CONG H Q,XIN C Y,ZHANG Y D,etal.Cloning of glutathione-S-transferase gene and primary expression analysis inGuzmaniawittmackii‘Attila’ induced by ethylene [J].MolecularPlantBreeding,2013,11(3):365-370(in Chinese with English abstract).

[27] JOFUKU K D,DEN BOER B G,VAN MONTAGU M,etal.Control ofArabidopsisflower and seed development by the homeotic geneAPETALA2[J].ThePlantCell,1994,6(9):1211-1225.

[28] WESSLER S R.Homing into the origin of the AP2 DNA binding domain [J].TrendsinPlantScience,2005,10(2):54-56.

[29] LICAUSI F,OHME-TAKAGI M,PERATA P.APETALA2/Ethylene responsive factor(AP2/ERF) transcription factors:mediators of stress responses and developmental programs [J].TheNewPhytologist,2013,199(3):639-649.

[30] LIU Y,ZHAO T J,LIU J M,etal.The conserved Ala37 in the ERF/AP2 domain is essential for binding with the DRE element and the GCC box [J].FEBSLetters,2006,580(5):1303-1308.

[31] OKAMURO J K,CASTER B,VILLARROEL,R,etal.The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins inArabidopsis[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997,94(13):7076-7081.

[32] NAKANO T,SUZUKI K,OHTSUKI N,etal.Identification of genes of the plant-specific transcription-factor families cooperatively regulated by ethylene and jasmonate inArabidopsisthaliana[J].JournalofPlantResearch,2006,119(4):407-413.

[33] WINTER D,VINEGAR B,NAHAL H,etal.An “Electronic Fluorescent Pictograph” browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets [J].PLoSONE,2007,2(8):718.

[34] CAI S,LASHBROOK C C.Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control:enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressingArabidopsisZINC FINGER PROTEIN2 [J].PlantPhysiology,2008,146(3):1305-1321.

[35] WILKINS O,NAHAL H,FOONG J,etal.Expansion and diversification of the populus R2R3-MYB family of transcription factors [J].PlantPhysiology,2009,149(2):981-993.

[36] HUANG Z,ZHAO P,MEDINA J,etal.Roles ofJnRAP2.6-likefrom the transition zone of black walnut in hormone signaling [J].PLoSONE,2013,8(11):75857.

[37] ZDARSKA M,DOBISOVA T,GELOVA Z,etal.Illuminating light,cytokinin,and ethylene signalling crosstalk in plant development [J].JournalofExperimentalBotany,2015,66(16):4913-4931.

[38] JU C,VAN DE POEL B,COOPER E D,etal.Conservation of ethylene as a plant hormone over 450 million years of evolution [J].NaturePlants,2015,1(1):14004.

[39] KRISHNASWAMY S,VERMA S,RAHMAN M H,etal.Functional characterization of four APETALA2-family genes(RAP2.6,RAP2.6L,DREB19 and DREB26) inArabidopsis[J].PlantMolecularBiology,2011,75(1/2):107-127.

[40] AGUSTI J,MERELO P,CERCOS M,etal.Comparative transcriptional survey between laser-microdissected cells from laminar abscission zone and petiolar cortical tissue during ethylene-promoted abscission in citrus leaves [J].BMCPlantBiology,2009,9:127.

[41] CHE P,LALL S,NETTLETON D,etal.Gene expression programs during shoot,root,and callus development inArabidopsistissue culture [J].PlantPhysiology,2006,141(2):620-637.

[42] SUN F,LIU P,XU J,etal.Mutation in RAP2.6L,a transactivator of the ERF transcription factor family,enhancesArabidopsisresistance toPseudomonassyringae[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2010,74(5/6):295-302.

[43] ASAHINA M,AZUMA K,PITAKSARINGKARN W,etal.Spatially selective hormonal control of RAP2.6L and ANAC071 transcription factors involved in tissue reunion inArabidopsis[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2011,108:1128-16132.

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Cloning and Expression Analysis ofAfERF113inAechemiafasciata

LEI Ming，LI Zhiying，WANG Jiabin, QIAO Fei and XU Li

(Ministry of Agriculture Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China, Institute of Tropical Crop Genetic Resources, Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737, China)

Cultivated bromeliads are important tropical ornamental flowering plants. However, it is little known about its molecular mechanism of growth and development regulation, and which in turn becomes a bottleneck for breeding and exploiting of new varieties. With the ornamental bromeliadsAechemiafasciataas material, based on its transcriptome data, a member of APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein (AP2/EREBP) was isolated by using rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology and was named asAfERF113. The length ofAfERF113cDNA was 1 093 bp, with an 864 bp open reading frame (ORF), which encodes a 287-amino acids deduced protein. The protein is acidic hydrophilic and with 29.768 5 ku molecular mass, 6.06 theoretical pI. It is a putative nuclear-localized protein with a conserved AP2 domain. Phylogenetic analysis indicated the domain belong to B-4 group of ERF subfamily and the protein is most close in genetic relationship withArabidopsisERF113. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results showed that the accumulation ofAfERF113transcripts was highest in roots of adult plants compared with other tested tissues of juvenile. Whereas, after treatment with exogenous ethylene for 1 h, the expression level ofAfERF113transcripts showed significant increase in all tested tissues either of juvenile or adult plants, indicating its rapid response to ethylene. These results provided a theoretical basis of further research ofAfERF113features and manipulating the growth and development of bromeliads using genetic approach in the near future.

Aechemiafasciata; AP2/EREBP family;AfERF113; Ethylene; Expression analysis

LEI Ming, male, Ph.D,assistant professor. Research area: the flowering molecular mechanism of bromeliads.E-mail:leiming_catas@126.com

XU Li, male,research fellow,doctoral supervisor.Research area:the molecular mechanism of the growth and development of bromeliads and bananas.E-mail:xllzy@263.net

常見(jiàn)廢棄量名稱與標(biāo)準(zhǔn)量名稱對(duì)照表

2016-04-23

2016-06-15

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(31372106)；海南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20163127)。

雷 明，男，博士，助理研究員，從事鳳梨科植物開(kāi)花分子機(jī)理研究。E-mail：leiming_catas@126.com

徐 立，男，研究員，博士生導(dǎo)師，從事鳳梨、香蕉等熱帶作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控研究。E-mail: xllzy@263.net

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1117.034.html

S682.39

A

1004-1389(2016)12-1851-10

Received 2016-04-23 Returned 2016-06-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No. 31372106); the National Science Foundation of Hainan Province (No. 20163127).