李銳，白建榮，2,，張叢卓，張效梅，閆蕾，楊瑞娟

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

利用SSR熒光標(biāo)記分析山西糯玉米農(nóng)家種的遺傳多樣性

李銳1，白建榮1，2,3，張叢卓1，張效梅3，閆蕾1，楊瑞娟1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

采取混合取樣策略，利用熒光SSR技術(shù)對來源于山西省的45份糯玉米地方品種和40個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在45個(gè)糯玉米地方品種中，共檢測出等位變異241個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)檢測出3～11個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)6個(gè)；多態(tài)性信息量（PIC）變化范圍在0.27～0.87，平均每個(gè)位點(diǎn)0.71；標(biāo)記索引指數(shù)（MI）變化范圍在1.35～9.53，平均每個(gè)位點(diǎn)4.42；聚類分析可將45份糯玉米地方品種劃分為4個(gè)類群。結(jié)果顯示，部分品種有許多特有的等位變異，應(yīng)引起特別的注意，需作進(jìn)一步的分析與研究。

SSR熒光標(biāo)記；糯玉米；地方品種；遺傳多樣性；山西

糯玉米（Zea mays L.ceratina Kulesh）的糯質(zhì)特性是由第9染色體發(fā)生的隱性突變（waxy）形成[1]。由于我國糯玉米主要是鮮食，因此，優(yōu)質(zhì)是糯玉米育種的首要目標(biāo)，即營養(yǎng)價(jià)值高，口感好，果穗商品性好。針對育種目標(biāo)，國內(nèi)外選育糯玉米自交系通常采用的方法主要有回交轉(zhuǎn)育法、雜交選育法和直接選系法。采用回交轉(zhuǎn)育法或雜交選育法育成的糯玉米品種，在一定程度上仍保持普通玉米品質(zhì)差的特性，這也正是造成目前我國糯玉米品種雖多，但符合鮮食要求的品種并不多的主要原因。采用直接選系法育成的糯玉米品種適口性較好，但用于直接選系的糯玉米地方品種大多遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，較難直接選系，選育的系配合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通玉米自交系，從而造成目前適口性好的鮮食糯玉米品種大多產(chǎn)量較低[2]。因此，強(qiáng)化種質(zhì)資源的研究，分析地方品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系，對于深化玉米遺傳研究、提高糯玉米育種水平具有重要的意義。

山西省地形復(fù)雜，形成了許多的生態(tài)小氣候。山西雖然不是糯玉米的起源地，但其他地方的糯玉米地方品種引進(jìn)山西后，經(jīng)多年的馴化后形成了較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和一些特殊的適應(yīng)性狀，并具有廣泛的遺傳變異性。到目前為止，很少有人對這些品種進(jìn)行過遺傳多樣性的研究，這些品種的親緣關(guān)系不清，育種利用非常困難。因此，研究和分析這些糯玉米地方品種的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，對于種質(zhì)的利用具有重要意義。

隨分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的各種分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)遺傳多樣性研究中，最先應(yīng)用于普通玉米種質(zhì)的遺傳多樣性研究中，隨后在分析糯玉米種質(zhì)遺傳多樣性方面也得到應(yīng)用[3-11]。但常規(guī)SSR的聚丙烯酰胺凝膠銀染法有許多缺點(diǎn)。為此，在表型特性分析基礎(chǔ)上[12]，本研究利用全自動(dòng)核酸分析儀SSR熒光標(biāo)記檢測技術(shù)，采用10株2池混合取樣方法，建立這些種質(zhì)的DNA指紋圖譜，并分析它們的遺傳多樣性，旨在為山西糯玉米地方種質(zhì)資源的保存和管理奠定基礎(chǔ)，對糯玉米新品種選育提供指導(dǎo)性的方法和思路，以提高糯玉米的育種效率和育種水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 糯玉米材料針對山西省不同的地域和氣候環(huán)境，廣泛征集、整理糯玉米地方品種100余份，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。由于長期保存發(fā)芽率下降，只選擇了符合試驗(yàn)要求的45份材料（表1）。

表1 山西糯玉米及其來源

1.1.2 SSR標(biāo)記的引物采用建立國家玉米品種指紋庫的20對核心引物和20對輔助核心引物[13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取、純化和檢測參照劉雪等[13]的方法混合提取群體DNA，每個(gè)群體4個(gè)樣本，每個(gè)樣本由10個(gè)單株（隨機(jī)取樣）的葉片混合而成。采用CTAB法提取并純化DNA，用分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和濃度，DNA的工作濃度設(shè)定為20 ng/μL備用。

1.2.2 擴(kuò)增與產(chǎn)物熒光檢測擴(kuò)增反應(yīng)在C1000擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，其中，10×PCR Buffer（25 mmol/L Mg2+）2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L SSR引物1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 U，DNA模板80 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在生物大分子分析儀上完成。

根據(jù)生物大分子分析儀軟件輸出的數(shù)值建立數(shù)據(jù)庫。標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性信息量（PIC）計(jì)算公式為PIC＝1-Σfi2，其中，fi為i位點(diǎn)的基因頻率。標(biāo)記索引系數(shù)（Marker Index，MI），按Senior等提供的公式計(jì)算，MI＝Allele×PIC，其中，Allele為該引物的等位基因數(shù)。

利用NTSYS-pc2.1軟件，按照UPGMA方法對各材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯玉米地方品種遺傳變異分析

由表2可知，45個(gè)糯玉米地方品種90個(gè)樣品在40個(gè)SSR位點(diǎn)共檢測出241個(gè)等位變異，每對引物檢測出3～11個(gè)等位變異，平均6個(gè)；其中，bnlgl702kl位點(diǎn)有11個(gè)等位變異，bnlg240kl位點(diǎn)有10個(gè)等位變異。40個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量PIC值變化范圍在0.27～0.87，數(shù)據(jù)大部分集中在0.60以上，平均0.71。標(biāo)記索引指數(shù)變化范圍在1.35～9.53，數(shù)據(jù)大部分集中在4～6，平均4.42?？傮w來看，供試糯玉米地方品種的遺傳多樣性豐富，且數(shù)據(jù)均一性較好。

表2 用于SSR分析的引物信息和檢測到的等位基因數(shù)目

2.245 個(gè)糯玉米地方品種的聚類分析

在相似系數(shù)0.67的位置將45份材料劃分為4大群，其中，第1群包括5個(gè)品種，第3群包括4個(gè)品種，第4群只有和順小白玉米，其余的在第2群。在相似系數(shù)大約0.69的位置將第2群的35個(gè)品種劃分為4個(gè)亞群（圖1）。

從圖1可以看出，大部分品種之間的相似系數(shù)小于0.8，顯示了45個(gè)糯玉米地方品種豐富的遺傳多樣性。在第2群的Ⅱ-2群中，隰縣黏玉米-2和祁縣小白玉米來源不同，但相似系數(shù)達(dá)到0.92。隰縣黏玉米-1和隰縣黏玉米-2來源相同，品名相同，但是相似系數(shù)僅為0.72；類似的情況還有吉縣黏玉米-1和吉縣黏玉米-2，相似系數(shù)僅0.71，劃分于2個(gè)亞群內(nèi)。

3 討論

3.1 熒光SSR標(biāo)記分析技術(shù)

基于生物大分子分析儀的SSR熒光標(biāo)記檢測技術(shù)是用熒光染料標(biāo)記SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，精確分析擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度。本研究首次將該技術(shù)應(yīng)用于玉米的遺傳多樣性分析研究中，具有的優(yōu)點(diǎn)為：（1）靈敏度高。傳統(tǒng)電泳系統(tǒng)由于染色的問題，某些條帶由于擴(kuò)增產(chǎn)物少而不顯色經(jīng)常出現(xiàn)缺帶的情況。由于生物大分子分析儀采用了熒光檢測，靈敏度極高，沒有出現(xiàn)這種情況，增加了數(shù)據(jù)的可靠性，并減少了重復(fù)驗(yàn)證的次數(shù)。（2）擴(kuò)增產(chǎn)物分辨率高。傳統(tǒng)電泳系統(tǒng)染色后，變性膠的分辨率在理論上為5 bp。但在實(shí)際操作中，往往由于電泳過程中整個(gè)膠面的電壓、電流和功率處于不斷的變化中，實(shí)際上電泳的遷移線隨著電泳時(shí)間的延長而變的不水平，有時(shí)彎曲的程度很大，成為弧形，這樣就影響了分辨率，特別是在滿板、多樣本的情況下，不知是實(shí)際片段長度的差異還是由于電場原因?qū)е拢斐勺x帶困難。生物大分子分析儀采用的是峰圖與膠圖結(jié)合的形式，讀數(shù)是用片段大小顯示，并且有膠圖作參考，結(jié)果準(zhǔn)確。這種結(jié)合的功能優(yōu)于定量PCR儀及測序儀等只有峰圖顯示的儀器。

3.2 糯玉米地方品種的收集與整理

由于地方品種是由當(dāng)?shù)剞r(nóng)民長期選種和保存下來的種質(zhì)，在長期生產(chǎn)和地方品種的擴(kuò)散過程中，難免出現(xiàn)不同品種之間的混雜，“一種多名”和“同名異種”現(xiàn)象。本研究收集的有些品種具有同一名稱，實(shí)際未必是同一個(gè)品種。例如，隰縣黏玉米-1和隰縣黏玉米-2來源相同，品名相同，但是是2個(gè)基因型；類似的情況還有吉縣黏玉米-1和吉縣黏玉米-2，相似系數(shù)僅0.71，劃分在2個(gè)亞群內(nèi)。另外，隰縣黏玉米-2和祁縣小白玉米來源不同，但相似系數(shù)達(dá)到0.92，基因型非常接近。這說明，地方品種僅從征集處得來的信息往往不可靠，有必要對這些地方品種作遺傳分析，為這些種質(zhì)資源的利用奠定基礎(chǔ)。另外，研究結(jié)果顯示，和順小白玉米單獨(dú)為一類，陽曲白黏玉米和陽曲黏玉米在第一類中屬于獨(dú)特的位置，這些品種可能有許多特有的等位變異，應(yīng)引起特別的注意，需作進(jìn)一步的分析與研究。

［1］Collins G N.A new type of Indian corn from China[J].Bureau of Plant Industry，1909，161：1-30.

［2］潘偉明.糯玉米生產(chǎn)現(xiàn)狀及其產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（6）：155-157.

［3］田孟良，黃玉碧，劉永建，等.SSR標(biāo)記揭示的云南省、貴州省糯玉米與普通玉米種質(zhì)資源的遺傳差異[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，21（3）：213-216.

［4］吳渝生，鄭用璉，孫榮，等.基于SSR標(biāo)記的云南糯玉米、爆裂玉米地方種質(zhì)遺傳多樣性研究[J].作物學(xué)報(bào)，2004，30（1）：36-41.

［5］張金渝，張建華，楊曉洪，等.用SSR標(biāo)記劃分云南糯玉米地方品種遺傳類群的研究[J].玉米科學(xué)，2007，15（1）：53-58.

［6］王鵬文，楊勇.利用SSR標(biāo)記劃分糯玉米的雜種優(yōu)勢群[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（3）：35-38.

［7］陳婧，楊引福，郭強(qiáng).利用SSR標(biāo)記分析40個(gè)糯玉米自交系遺傳多樣性[J].玉米科學(xué)，2009，17（4）：32-35.

［8］陳坤，楊昌河.48份糯玉米自交系遺傳多樣性的SSR標(biāo)記[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：1-3.

［9］雍洪軍，張世煌，張德貴，等.利用SSR熒光標(biāo)記分析90個(gè)糯玉米地方品種的遺傳多樣性[J].玉米科學(xué)，2009，17（1）：6-12.

［10］劉麗君，張丹，薛林，等.基于SSR標(biāo)記的江蘇沿江地區(qū)糯玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（4）：723-729.

［11］程宇坤，白建榮，張效梅，等.山西省糯玉米自交系的遺傳多樣性分析及類群劃分[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：433-438.

［12］張叢卓，白建榮，張效梅，等.山西糯玉米地方資源的表型特性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：131-133，139.

［13］WangF G，Tian H L，Zhao J R，et al.Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties[J].Maydica，2010，56：1-11.

［13］劉雪，李明順，李新海，等.利用SSR標(biāo)記分析玉米群體遺傳變異的取樣方法[J].作物學(xué)報(bào)，2005，31（7）：858-863.

Analysis of Genetic Diversity of Waxy Corn Landraces in Shanxi Using Fluorescent SSR Markers

LI Rui1，BAI Jianrong1，2，3，ZHANGCongzhuo1，ZHANGXiaomei3，YANLei1，YANGRuijuan1
（1.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Research Center ofModern Agriculture，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China）

Genetic diversity and genetic variation of waxy corn landraces in Shanxi were analyzed with 40 fluorescent SSR loci by using a bulk sampling strategy.The result showed that totally 241 alleles in 45 corn landraces were detected with an average of 6 ranged from 3 to 11 per locus.PIC among them ranged from 0.27 to 0.87 with an average of0.71 per locus.MI among them ranged from 1.35 to 9.53 with an average of 4.42 per locus.The 45 landraces were clustered into 4 groups.The results showed that some of them had their particular alleles,so that they should be paid more to study further.

fluorescent labeled SSR marker；waxy corn；landraces；genetic diversity；Shanxi

S513.032

A

1002-2481（2016）10-1433-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.10.02

2016-06-01

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311002-8）

李銳（1974-），男，山西靜樂人，助理研究員，碩士，主要從事分子育種研究工作。白建榮為通信作者。