梁從蓮，陳燕文，蘇征，楊冰冰，張金成，李佳，蒲高斌,張永清

(山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250355)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

丹參組培條件優(yōu)化研究

梁從蓮，陳燕文，蘇征，楊冰冰，張金成，李佳，蒲高斌,張永清*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250355)

為優(yōu)化丹參組培快繁體系,以帶腋芽的丹參植株嫩莖為外植體，觀察在不同組成培養(yǎng)基上和不同培養(yǎng)條件下的叢生芽誘導(dǎo)及生根情況，確定最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+蔗糖(3×104mg/L)+瓊脂(7×103mg/L)對丹參叢生芽誘導(dǎo)作用最好；1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭( 5×102mg/L)+蔗糖(2×104mg/L)+瓊脂(7×103mg/L)最有利于組培苗生根，組培苗的最佳生根溫度為22 ℃。優(yōu)化的丹參組培快繁體系，可用于丹參良種無性快繁，也可用于良種復(fù)壯及脫毒。

丹參；組織培養(yǎng)；快速繁殖；條件優(yōu)化

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.) 的干燥根及根莖，可活血祛淤、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰[1]，被廣泛用于治療心腦血管系統(tǒng)等疾病，屬于大宗常用中藥材之一。目前丹參主要依靠人工栽培滿足需要，山東、河南、河北、陜西、甘肅以及四川等地均有大面積種植，僅山東種植面積就達20萬畝(1畝=666.7 m2)。在栽培生產(chǎn)中，如何提高丹參藥材產(chǎn)量與質(zhì)量備受人們關(guān)注，解決此問題最有效的途徑就是選育和推廣種植優(yōu)良品種。關(guān)于丹參優(yōu)良品種選育研究目前已有很大進展[2]，但在獲得優(yōu)良品種后如何充分有效地發(fā)揮作用卻面臨著兩個方面的問題：一是如何盡快繁育、迅速推廣；二是丹參在許多地區(qū)是以根段進行繁殖的，長期營養(yǎng)繁殖容易導(dǎo)致品質(zhì)退化或病毒病傳播，需要進行品種脫毒復(fù)壯。組培快繁技術(shù)是解決丹參快繁和丹參種苗脫毒復(fù)壯的有效手段。趙東利等[3]研究發(fā)現(xiàn)在幼莖、幼葉和花蕾等3種外植體中,幼莖為最佳外植體，在IAA，IBA和NAA 3種激素中,以1/2 MS+ IBA 0.5 mg/ L為最佳的丹參試管苗生根培養(yǎng)基。房師梅等[4]以紫花丹參莖尖、莖段、葉片和花蕾為試材，發(fā)現(xiàn)莖段成活率最高，丹參小苗頂芽在MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)中誘導(dǎo)叢生芽效果最好。周建國等[5]研究發(fā)現(xiàn)MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)為最適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。解曉紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)試管苗生根以MS+ IBA(1.0 mg/L)+ KT(1.0 mg/L)最好。但他們對丹參組培苗生根溫度的研究較少，且很少對結(jié)果進行系統(tǒng)的分析。為提高丹參良種組培快繁效率，我們在前人研究基礎(chǔ)上，以丹參嫩莖為外植體，以6-BA和NAA為芽誘導(dǎo)生長調(diào)節(jié)劑，以IBA和 KT為生根生長調(diào)節(jié)劑進行最佳植物生長調(diào)節(jié)劑比例的探索，并在此基礎(chǔ)上對生根溫度進行研究，同時利用統(tǒng)計學(xué)中的卡方檢驗對結(jié)果進行深入分析，進一步優(yōu)化了組培條件，完善了丹參組培快繁技術(shù)體系，為大批量生產(chǎn)丹參優(yōu)質(zhì)種苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 供試材料

丹參植株嫩莖采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定，確認為唇形科植物丹參。

1.2 試藥

硝酸鉀(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，2013-3-15)；硝酸銨(西亞試劑，M16715)；磷酸二氫鉀(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，2008-5-22)；硫酸鎂(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司2010-10-24)；氯化鈣(天津市博迪化工股份有限公司，2009-11-25)；碘化鉀(天津市博迪化工股份有限公司，2014-9-27)；硼酸(天津市鼎盛鑫化工有限公司，2014-01-08)；硫酸錳(天津市博迪化工股份有限公司，2014-2-20)；硫酸鋅(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,F20080721)；鉬酸鈉(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，2013-5-30)；硫酸銅(天津市巴斯夫化工有限公司，2012-4-21)；氯化鈷(天津市大茂化學(xué)試劑廠，2015-3-04)；肌醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，2008-11-29)；甘氨酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，2014-7-10)；鹽酸硫胺素(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20130527)；鹽酸吡哆醇(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，130326)；煙酸(天津市光復(fù)精細化工研究所，2014-2-19)；乙二胺四乙酸二鈉(聯(lián)試化工試劑有限公司，20000301)；硫酸亞鐵(天津市化學(xué)試劑三廠，2008-5-30)；次氯酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20150701)；無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，XK 13-011-00015)；6-芐氨基嘌呤(6-BA)(北京索萊寶科技有限公司，625A055)；萘乙酸(NAA)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，Q/12HB 4308-2009)；吲哚丁酸(IBA)(北京索萊寶科技有限公司，302A0322)；激動素(KT)(北京索萊寶科技有限公司，202C034)；蔗糖(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20141224)；瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司，402H0320)；活性炭(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，20150815)。

2 方法

2.1 外植體處理和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

取帶腋芽嫩莖，去葉，留葉柄基部，剪成長約2 cm帶腋芽小段，清洗去表面附著物，在超凈工作臺上用3.148×104mg/L的次氯酸鈉溶液(加2～3滴吐溫)消毒15～20 min，無菌水沖洗2～3次，后用75%乙醇消毒2次，每次20～30 s，再用無菌水沖洗2～3次。然后用無菌濾紙吸去水分接種到添加有不同種類和質(zhì)量濃度配比植物生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。20 d后統(tǒng)計外植體的出芽率。出芽率=(出芽的外植體個數(shù)/接種的外植體成活個數(shù))×100%。培養(yǎng)條件為光照時間14 h/d，光照強度2000 lx，培養(yǎng)溫度24～26 ℃。

2.2 生根培養(yǎng)

將芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的幼嫩枝條，從基部切取并分節(jié)轉(zhuǎn)入不同生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。 第10 天和第20 天時分別統(tǒng)計丹參組培苗的生根率。培養(yǎng)條件為光照時間12 h/d，光照強度2000 lx，培養(yǎng)溫度24～26 ℃。根據(jù)前人經(jīng)驗[7-8]，以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，探討植物生長調(diào)節(jié)劑最佳組合、培養(yǎng)基最佳組成。再將幼嫩枝條從基部切取并分節(jié)轉(zhuǎn)入最優(yōu)生根培養(yǎng)基上，在不同培養(yǎng)溫度下進行生根培養(yǎng)。每組處理接種枝節(jié)25個。

3 結(jié)果與分析

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對丹參叢生芽的誘導(dǎo)作用

植物生長調(diào)節(jié)劑對丹參組培苗的芽誘導(dǎo)作用見表1。對表1數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，結(jié)果Pearsonχ2=159.228，ν=7，P=0.000(<0.05)，可見不同處理間有差異。經(jīng)進一步多重檢驗分析，發(fā)現(xiàn)1組，2組，3、4、7、8組和5、6組組內(nèi)無顯著性差異，但各組間差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義。細胞分裂素6-BA主要促進芽的發(fā)生，NAA能促進細胞分裂與擴大。表1數(shù)據(jù)顯示，單獨添加6-BA或NAA效果都不很理想，NAA在誘導(dǎo)丹參芽發(fā)生中并不能起主導(dǎo)作用，但在使用6-BA同時加入一定量NAA可顯著提高6-BA促進芽發(fā)生的作用，培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L時，誘導(dǎo)叢生芽效果最好。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對丹參組培苗的芽誘導(dǎo)作用

3.2 培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)溫度對丹參組培苗生根的影響

3.2.1 培養(yǎng)基組成對丹參組培苗生根的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑對丹參組培苗生根的影響見表2。 對在植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的丹參枝條生根率采用χ2檢驗，結(jié)果Pearson χ2=17.121，=9，P=0.047(<0.05)，提示在植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的丹參枝條生根率不同。深入分析發(fā)現(xiàn)，14、15組處理與其他各組處理間有顯著性差異，但其他各組之間差異不顯著。表2結(jié)果顯示，IBA可促進生根，但單獨添加IBA效果不理想，KT的主要作用是誘導(dǎo)生芽，但配合一定量IBA使用可顯著提高丹參組培苗的生根能力。培養(yǎng)基中添加IBA 1.0 mg/L和KT 1.0 mg/L，有利于丹參組培苗生根，生根率可達100%。

培養(yǎng)基組成對生根的影響見表3。對在基本組成不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的丹參枝條生根率采用2檢驗，結(jié)果Pearson2=44.333，=6，P=0.000(<0.05)，說明基本組成不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的丹參枝條生根率不同。進一步分析發(fā)現(xiàn)，22、23、24組和19、20、25組的組內(nèi)處理之間結(jié)果無顯著性差異，但兩組之間及和21組處理之間差異顯著，說明蔗糖質(zhì)量濃度對生根率影響較大。表3結(jié)果顯示，MS和蔗糖都減少，生根率可顯著提高，提示營養(yǎng)成分減少改變了碳氮比而利于生根；在蔗糖和MS都減少時，向培養(yǎng)基中添加活性炭有利于丹參組培苗生根，推測與活性炭可為生根提供暗環(huán)境有關(guān)，但活性炭用量并不是越多越好，而是存在一定合適的范圍[9]。本實驗考察了3個活性炭用量，發(fā)現(xiàn)每升培養(yǎng)基添加5×102mg/L 活性炭最利于生根。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對丹參組培苗生根的影響

表3 培養(yǎng)基基本組成對丹參組培苗生根的影響

3.2.2 培養(yǎng)溫度對丹參組培苗生根的影響

在探索生根培養(yǎng)基最佳組成的基礎(chǔ)上，將組培苗幼嫩枝條轉(zhuǎn)入最優(yōu)生根培養(yǎng)基上，即1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭(5×102mg/L)+蔗糖(2×104mg/L)+瓊脂(7×103mg/L)，在不同溫度下培養(yǎng)10 d和20 d后分別統(tǒng)計組培苗生根率。結(jié)果見表4。

對不同溫度下的20 d生根率采用χ2檢驗，結(jié)果Pearsonχ2=6.450，=3，P=0.092(>0.05)，各處理結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于樣本量偏小造成的。由表4數(shù)據(jù)可以看出，培養(yǎng)溫度在22 ℃時丹參組培苗的生根數(shù)最多。

不同條件下處理的生根率見表5。對處理20d的生根率采用χ2檢驗，結(jié)果Pearsonχ2=62.570，=4，P=0.000(<0.05)，顯示不同條件下處理20 d后生根率有差異，深入研究發(fā)現(xiàn)30、31、32組與33、34組組內(nèi)處理間無顯著差異，而組間差異顯著。表5結(jié)果顯示，MS、蔗糖均減少，培養(yǎng)基中添加5×102mg/L活性炭和1.0 mg/L IBA、1.0 mg/L KT最有利于丹參組培苗的生根。

表4 培養(yǎng)溫度對丹參組培苗生根的影響

表5 不同條件組合對丹參組培苗生根的影響

4 結(jié)果與討論

丹參屬于常用大宗中藥材，市場需求量逐年增大，組織培養(yǎng)技術(shù)可以使選育的良種快速在短時間內(nèi)大量繁殖，也可解決長期根段營養(yǎng)繁殖導(dǎo)致的品種退化和病毒病問題，而確定合適的組織培養(yǎng)條件是解決上述問題的基礎(chǔ)，故而近年來有關(guān)優(yōu)化丹參組培條件的研究報道日益增多。本實驗在前人研究[3-8]基礎(chǔ)上，著重考察了植物生長調(diào)節(jié)劑對丹參組培苗出芽和生根的影響，以及培養(yǎng)溫度和活性炭用量對丹參組培苗生根的影響，采用卡方檢驗對結(jié)果進行系統(tǒng)分析，驗證了營養(yǎng)成分用量應(yīng)減少的合理性。結(jié)果顯示，叢生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+蔗糖(3×104mg/L)+瓊脂(7×103mg/L)，與周建國等[5]的研究結(jié)果一致。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+活性炭(5×102mg/L)，與解曉紅等[6]篩選出的最佳生根培養(yǎng)基植物調(diào)節(jié)劑用法用量一致，但他們并未添加活性炭，鑒于添加一定量的活性炭可以促進丹參組培苗生根，且成本并不高，建議添加。在設(shè)置的溫度梯度中，組培苗的最佳生根溫度為22 ℃，另據(jù)黃春球等的研究[10]，溫度光照信號總是相互聯(lián)系的，即植物以定性、定量的方式對溫度和光照作出反應(yīng)，當植物組織在培養(yǎng)基中被誘發(fā)重建時,需要較高的光照水平和適宜的溫度,因為溫度是通過包括基因功能的調(diào)節(jié)、各種酶活性和膜特性的控制,以及某些物質(zhì)如激素水平的控制調(diào)節(jié)等來影響植物生長發(fā)育的生理生化代謝過程以影響生長,只有在適宜的溫度條件下,試管植株的光合作用才能正常進行。本研究只對溫度影響進行了考察，且梯度較大，將溫度梯度縮小，與光照聯(lián)合起來考察對生根的影響則有待進一步地研究。由于不同研究者的優(yōu)化條件不盡相同，建議深入研究時要考慮丹參品種差異的影響，以使條件真正優(yōu)化，節(jié)約成本且創(chuàng)造更高的經(jīng)濟效益。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:76-77.

[2]王晨,李佳,張永清.丹參種質(zhì)資源與優(yōu)良品種選育研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥,2012,14(4):37-42.

[3]趙東利,曹雪梅,邱桂佳,等.丹參的組織培養(yǎng)及植株再生[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2010,25(2):5-7.

[4]房師梅，雷世俊，王洪波，等.丹參組培快繁技術(shù)研究[J].北方園藝2013(21):123-126

[5]周建國,劉珊珊,毛志遠,等.丹參組織培養(yǎng)技術(shù)的初步研究[J].食品與藥品,2015,17(2):93-95.

[6]解曉紅,李江輝,馮文龍,等.丹參組培快繁技術(shù)研究[J].中藥材,2004,27(7):474-475.

[7]王維婷,單成鋼,房翠萍,等.丹參組織培養(yǎng)及其再生體系的建立與優(yōu)化[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2011,25(4):21-23.

[8]孟倩,孔祥生,張改娜.不同植物生長調(diào)節(jié)劑對丹參組培快繁的影響[J].北方園藝,2013(9):102-105.

[9]孫占育,孫志強,曹斌.活性炭在促進組培苗植物生根中的作用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(7):3-5.

[10]黃春球,宋天順,李明靜,等.外界條件對白及組織培養(yǎng)的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報,2010,16(21):42-43.

Conditions optimization of tissue culture technique ofSalviaMiltiorrhizaBge.

LIANG Cong-lian, CHEN Yan-wen, SU Zheng, YANG Bing-bing,ZHANG Jin-cheng, LI Jia, PU Gao-bin, ZHANG Yong-qing*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶To optimize rapid propagation of tissue culture technique ofSalviamiltiorrhizaBge., we addressed the impact of its tissue-cultured plantlets by different plant growth regulators and different culture conditions with tender stems with axillary bud as explants. Results show that the most effective induction to axillary buds is MS+6-BA(1.0 mg/L)+NAA(0.5 mg/L)+sucrose(3×104mg/L)+agar(7×103mg/L). The most favorable rooting conditions of tissue culture seedling are 1/2MS+IBA(1.0 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+activated carbon(5 ×102mg/L)+sucrose(2×104mg/L)+agar(7×103mg/L) and 22 ℃ . This technique can be applied to rapid propagation, rejuvenation and detoxification ofSalviamiltiorrhizaBge.

∶SalviamiltiorrhizaBge.; tissue culture; rapid propagation; conditions optimization

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.006

2016-03-17

山東省科技發(fā)展計劃(2008GG2NS02022)。

梁從蓮(1990—)，女，碩士研究生，研究方向為中藥資源及其質(zhì)量控制。E-mail:837309887@qq.com

*通信作者，張永清(1962—)，男，理學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥資源及其質(zhì)量控制。E-mail:zyq622003@126.com

R282；S567.5+3

A

1002-4026(2016)05-040-05