季蕾，陳貫虹，傅曉文，黃玉杰，王加寧，張強

(山東省科學院生態(tài)研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 山東 濟南 250014)

【環(huán)境與生態(tài)】

生物酶對五氯聯(lián)苯降解的初步研究

季蕾，陳貫虹，傅曉文，黃玉杰，王加寧，張強*

(山東省科學院生態(tài)研究所, 山東省應用微生物重點實驗室, 山東 濟南 250014)

多氯聯(lián)苯(PCBs)是具有代表性的持久性有機污染物(POPs)，其氯代數(shù)目越多，降解越難。本文以分離篩選的6株P(guān)CBs降解細菌為材料，制備了含有NADH輔酶再生系統(tǒng)關(guān)鍵酶甲酸脫氫酶(FDH)的PCBs降解復合酶，研究了其對PCBs的降解效果。結(jié)果表明，Pseudomonassp. MGB11胞內(nèi)酶/FDH復合酶對五氯聯(lián)苯PCB114的降解率在10 h內(nèi)可達69.4%，對于高毒性、難降解的高氯PCBs的污染修復具有應用價值。

五氯聯(lián)苯; 降解復合酶; 甲酸脫氫酶

工業(yè)化學品多氯聯(lián)苯(PCBs)是首批被列入國際持久性有機污染物( persistent organic pollutants， POPs)公約的污染物，具有持久性、半揮發(fā)性、長距離遷移性、生物蓄積性和高毒性的污染特性[1]，其氯化程度越高，越難分解。五氯聯(lián)苯作為高氯PCBs，與低氯代物相比，具有更高的毒性和持久性[2]。目前，POPs污染事故仍不斷發(fā)生，及時、有效地修復污染環(huán)境，對人類健康和經(jīng)濟發(fā)展至關(guān)重要。

微生物降解因其低耗、易于實現(xiàn)原位修復、環(huán)境安全和純生態(tài)過程的顯著優(yōu)點[3]，是公認的治理PCBs污染的一種環(huán)保而有效的手段。好氧微生物能夠把低氯PCBs(nCl<5)氧化為氯代苯甲酸，但很難降解高氯PCBs(nCl≥5)[4]；厭氧生物過程將高氯PCBs還原成低氯PCBs，但不能破壞苯環(huán)結(jié)構(gòu)[5]，PCBs好氧開環(huán)過程需要聯(lián)苯雙加氧酶等NADH依賴型氧化還原酶[6-8]。NADH的持續(xù)供給可通過高效、低成本的甲酸/FDH(甲酸脫氫酶) 輔酶再生系統(tǒng)實現(xiàn)[9]。

本研究針對微生物降解高氯PCBs周期長、效率低的問題，以五氯聯(lián)苯為降解底物，選用實驗室自行分離篩選的6株P(guān)CBs降解好氧細菌，制備含有NADH輔酶再生系統(tǒng)關(guān)鍵酶FDH的PCBs降解復合酶，提高高氯PCBs的降解效率，以實現(xiàn)對PCBs污染的快速修復。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

聯(lián)苯(國藥集團)；PCB114(2,3,4,4',5-Pentachlorobiphenyl)(Sigma-Aldrich)；正己烷為色譜純；其他化學試劑為分析純。

6株P(guān)CBs降解菌均由本實驗室分離并保存，分別為Burkholderiasp. MGB112、Sphingomonassp. MGB12、Pseudomonassp. MGB11、Rhodococcussp. MGB10、Arthrobactersp. MGB09、Pseudomonassp. VM14。

表達博伊丁假絲酵母fdh基因的基因工程大腸桿菌E.coliBL21-fdh由本實驗室構(gòu)建，用于FDH的制備。

誘導培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 0.2 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，聯(lián)苯1.0 g/L，pH=7.0。

ZYP培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO46.8 g/L，(NH4)2SO43.3 g/L，CaCl20.02 g/L，MgSO40.24 g/L，0.5%甘油，葡萄糖0.5 g/L，乳糖2 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCBs降解酶制備

6株P(guān)CBs降解菌分別在30 ℃、150 r/min條件下用誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，分別收集菌體及上清液，菌體用10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)稀釋至原濃度的1/20，在250 W、3 s/5 s條件下進行細胞破碎20 min，離心，上清為粗酶液。

1.2.2 FDH制備及活性檢測

E.coliBL21-fdh在37 ℃、150 r/min條件下經(jīng)ZYP培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，菌體稀釋至原濃度的1/20，在200 W、3 s/3 s條件下進行細胞破碎6 min，離心，上清為粗酶液。

FDH活性檢測：反應體系中甲酸鈉1 670 mmol/L，NAD 16.7 mmol/L，10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)2 mL，加入適當稀釋的酶液1 mL，蒸餾水補足4 mL，30 ℃反應5 min，測定反應前后340 nm處的吸光值，根據(jù)標準曲線計算酶活力。酶活力定義為1 min催化產(chǎn)生1 μmol NADH所需的酶量為1 U。

1.2.3 菌株對PCBs降解

不同菌株分別在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和后，各取2 mL菌液8 000 r/min離心5 min，菌體用滅菌蒸餾水清洗2次，重懸后分別接種至50 mL 濃度為1 mg/L 的PCB114溶液中，置于搖床中30 ℃、150 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后測定PCB114的降解率。

1.2.4 PCBs的酶降解

反應體系為10 mL，其中10 mmol/L PBS緩沖液(pH=7.5)5 mL，PCBs降解酶1 mL，F(xiàn)DH 酶液1 mL，蒸餾水補足至10 mL。PCB114 終濃度1 mg/L，甲酸鈉1 670 mmol/L，30 ℃水浴反應8 h后測定降解率。

1.2.5 PCBs萃取及檢測

反應體系中加入10 mL正己烷，充分震蕩后超聲5 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置分層后分離上下相，萃取3次，合并萃取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，旋蒸后定容至5 mL，GC-MS法測定PCB114含量。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱，進樣口溫度280 ℃，柱溫100 ℃保持1 min后，升至280 ℃保持4 min，載氣流速為1 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源(EI)，能量70 eV，阱溫220 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲5 min。定量分析選擇SIM模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對PCBs的降解

6株P(guān)CBs降解菌經(jīng)1 g/L聯(lián)苯誘導，可達到的飽和生物量如表1所示。Pseudomonassp. MGB11的菌體密度最大，其OD600值為2.05；Pseudomonassp. VM14生物量達飽和時的OD600值僅為0.57，6株細菌在誘導培養(yǎng)基中所達到的飽和菌體密度均較低。收集菌體轉(zhuǎn)接至PCB114培養(yǎng)基中，7 d后有3株菌的降解率達到20%以上，其中Pseudomonassp. MGB11降解率最大，為29%(表1)，其降解能力與生物量保持一致。

表1 PCBs降解菌在誘導培養(yǎng)基中的飽和生物量和PCB114降解率

2.2 復合酶對PCBs的降解

E.coliBL21-fdh經(jīng)誘導產(chǎn)酶后，收集細胞并破碎，獲得的粗酶液FDH酶活力為0.633 U/mL。分別制備6株P(guān)CBs降解菌的粗酶液，與FDH粗酶按照1:1(V/V)的比例進行復配，添加至PCB114濃度為1 mg/L的降解體系，反應8 h后，PCB114降解率結(jié)果如表2所示。

表2 不同復合酶對PCB114的降解率

注：CK為MGB112粗酶液(未添加FDH)。

結(jié)果顯示，8 h后MGB112、MGB11、VM14對PCB114降解率分別為57.1%、65.7%、40%，其中Pseudomonassp. MGB11胞內(nèi)酶/FDH復合酶對PCB114的降解率最高(65.7%)。Burkholderiasp. MGB112胞內(nèi)酶/FDH復合酶的PCB114降解率(57.1%)與其胞內(nèi)酶單獨作用8 h相比(7.5%)提高了6.6倍。

2.3 PCBs降解酶在細胞不同部位的分布

菌株P(guān)seudomonassp. MGB11經(jīng)培養(yǎng)后，對其培養(yǎng)液、菌體破碎液的PCB114降解能力進行比較，結(jié)果顯示，在8 h內(nèi)，Pseudomonassp. MGB11胞內(nèi)酶/FDH對PCB114的降解率達67.5%，而添加胞外上清液/FDH的體系中未檢測到降解活性，表明具有PCBs降解活性的酶主要存在于胞內(nèi)，而不分泌到胞外培養(yǎng)液中。Ruiz-Aguilar等[10]報道，來源于細菌的PCBs降解酶大多為胞內(nèi)酶，而白腐真菌可分泌胞外過氧化物酶降解

圖1 復合酶Pseudomonas sp. MGB11胞內(nèi)酶/FDH對PCB114的降解曲線Fig.1 Degradation curve of intracellular enzyme of Pseudomonas sp. MGB11 /FDH to PCB114

PCBs，與好氧細菌相似，降解速率與含氯量成反比，降解四氯代以上的PCBs仍比較困難。

2.4 復合酶對PCB114的降解曲線

在短時間內(nèi)實現(xiàn)PCB114高效降解的復合酶Pseudomonassp. MGB11胞內(nèi)酶/FDH，對1 mg/L PCB114的降解曲線見圖1。結(jié)果顯示，經(jīng)8～10 h降解后，復合酶對底物的降解速率趨于穩(wěn)定，10 h時PCB114降解率達69.4%。

3 討論

目前關(guān)于高氯代PCBs降解的相關(guān)研究報道較少，多為低氯PCBs降解的相關(guān)研究。胡星等[11]篩選獲得的假單胞菌SYC01對四氯聯(lián)苯PCB77(0.5 mg/L)、PCB52(0.1 mg/L)的降解率分別為34%、68%。Sierra等[12]分離的好氧菌Janibactersp. MS3-02對四氯聯(lián)苯Aroclor1242在7 d內(nèi)的降解率為70%。本文中，對更難降解的毒性類二噁英類PCBs[13]，降解酶系僅需10 h即可降解69.4%，具有更快的降解速率。此外，微生物降解高氯PCBs的過程，一般需要先經(jīng)過厭氧脫氯后，更易于好氧開環(huán)降解生成小分子。本文所使用的好氧微生物胞內(nèi)酶，直接通過好氧過程可將高氯PCBs降解，操作工藝簡單，適用于原位污染修復。

在PCBs污染修復方面，厭氧脫氯的研究僅局限于菌種的分離和脫氯機理的研究，而在分子生物學及酶學方面仍處于空白階段，好氧生物降解主要集中在PCBs降解菌株的篩選、降解機理及降解相關(guān)的酶和基因方面的研究[14]，對于構(gòu)建具有輔酶再生功能的高氯PCBs降解復合酶的相關(guān)研究尚屬首次[15]。

利用分離篩選、富集或基因工程構(gòu)建獲得的具有特定降解功能的微生物，通過發(fā)酵工程及酶工程手段，提取相關(guān)酶或酶系，制備復合酶或經(jīng)固定化后，用于PCBs污染土壤、水體及有機污染場地的修復，是極具應用潛力的環(huán)境治理途徑。本研究將輔酶再生系統(tǒng)關(guān)鍵酶FDH引入PCBs降解復合酶的構(gòu)建，實現(xiàn)好氧條件下對高氯代PCBs的高效降解，周期短、降解能力強、成本低且操作工藝簡單，在污染環(huán)境治理、生態(tài)修復方面具有應用價值。

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Pilot study on bioenzyme degradation to pentachlorodiphenyl

JI Lei, CHEN Guan-hong, FU Xiao-wen, HUAGN Yu-jie, WANG Jia-ning, ZHANG Qiang*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

∶ Polychlorinated biphenyls (PCBs) is a representative of persistent organic pollutants (POPs). More its chlorinated number leads to more difficult its degradation . We prepared PCBs compound degrading enzyme of key enzyme formate dehydrogenase (FDH) of NADH coenzyme regeneration system with isolated 6 PCBs degradation bacteria strains as materials. We address its degrading effect to PCBs. Results indicate that degradation rate of Pseudomonas sp. MGB11/FDH compound enzyme to pentachlorodiphenyl PCB114 is up to 69.4% within 10 h. It therefore has application value in the repair for high chlorine PCBs pollutants with high toxicity and low degradability.

∶ pentachlorodiphenyl; compound degrading enzyme; formate dehydrogenase

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.015

2016-08-08

國家國際科技合作專項(2014DFE90100)；山東省自然科學基金(ZR2015YL008, BS2015HZ011)

季蕾(1985—)，女，博士，研究方向為生態(tài)修復。

*通信作者。E-mail：zhbuaiji@sina.com。

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1002-4026(2016)06-094-04