王冰 ，王友鳳，李靜，王燕，張偉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

正交優(yōu)選補(bǔ)腎活血顆粒中補(bǔ)骨脂和丹參等藥的乙醇提取工藝

王冰1，王友鳳1，李靜2*，王燕2，張偉2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033)

優(yōu)化了補(bǔ)腎活血顆粒中以補(bǔ)骨脂和丹參為代表的醇提組提取工藝。采用正交試驗(yàn)方法，以補(bǔ)骨脂中異補(bǔ)骨脂素和丹參中丹參酮IIA的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)和乙醇用量4個(gè)因素。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為加12倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。該方法優(yōu)選得到的提取工藝簡(jiǎn)單合理、準(zhǔn)確可行,為后續(xù)的優(yōu)選水提和制粒工藝提供了必要條件。

正交試驗(yàn)；異補(bǔ)骨脂素；丹參酮IIA；提取工藝；補(bǔ)腎活血顆粒

補(bǔ)腎活血顆粒是青島市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科治療慢性心力衰竭的科研協(xié)定處方，在補(bǔ)腎活血湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行的劑型研究。該方由制附子(黑順片)、鹽補(bǔ)骨脂、熟地黃、酒山茱萸、黨參、黃芪、丹參、赤芍、炒葶藶子和大棗10味藥組成。根據(jù)該制劑每味藥材的化學(xué)成分和藥理作用分為水提組和醇提組，其中附子、補(bǔ)骨脂、山茱萸和丹參為醇提組，其余6味為水提組。本試驗(yàn)采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法,以醇提溶液中異補(bǔ)骨脂素、丹參酮ⅡA的含量為指標(biāo)，確定以丹參、補(bǔ)骨脂為代表的醇提組最佳醇提工藝。

1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；CPA2250 型電子分析天平(美國(guó)Sartorius公司)； BuchiR215V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；DRHH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；WND-200A型高速中藥粉碎機(jī)(浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司)；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 ( 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào): 0378-200108) ；丹參酮 IIA對(duì)照品( 中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110766-201520) ；甲醇為色譜純 ( 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司) ；水為超純水，其余試劑均為分析純。藥材附子(黑順片)、酒山茱萸、鹽補(bǔ)骨脂、丹參(購(gòu)自安國(guó)市平安藥業(yè)有限公司)，經(jīng)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室張偉主任藥師鑒定黑順片為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品；酒山茱萸為豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep. 的干燥根和根莖；鹽補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleaecorylifoliaL. 的干燥成熟果實(shí)；丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖。

2 試驗(yàn)方法

2.1 正交試驗(yàn)方法

采用正交試驗(yàn)優(yōu)選醇提條件，分別以9組醇提溶液中異補(bǔ)骨脂素、丹參酮IIA的含量為指標(biāo)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)和乙醇用量4個(gè)因素、3個(gè)水平進(jìn)行考察。正交因素和水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素和水平表

2.2 異補(bǔ)骨脂素測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Venusil XBP-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶水(55∶45，V/V)為流動(dòng)相；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm。供試品、陰性樣品和對(duì)照品色譜見圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取異補(bǔ)骨脂素4.14 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

將附子、補(bǔ)骨脂、山茱萸和丹參粉碎成粗粉，稱取藥材粗粉共9份，每份1/5處方量(約31 g)，精密稱重。按照L9(34)正交設(shè)計(jì)表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，收集提取液，濾過，濾渣備用，濾液濃縮轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，加相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

1峰 異補(bǔ)骨脂素；a 陰性樣品；b 異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品；c 供試品。圖1 醇提液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of alcohol extract

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

取除補(bǔ)骨脂之外的3味藥粗粉，按1/5處方量(約28 g)，精密稱取，加12倍量70%乙醇回流1.5 h，提取1次，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶，定容至刻度，即得陰性樣品溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL分別置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得異補(bǔ)骨脂素回歸方程：Y=72.501X-9.572 3(R=0.999 7)。表明異補(bǔ)骨脂素濃度在8.28～82.8 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 丹參酮IIA測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件

色譜柱為 Venusil XBP-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以甲醇∶水(75∶25，V/V)為流動(dòng)相；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。供試品、陰性樣品、對(duì)照品色譜見圖2。

2峰 丹參酮IIA；d 丹參陰性樣品；e 丹參酮IIA對(duì)照品；f 供試品。圖2 醇提液HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of alcohol extract

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹參酮IIA1.80 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得。

2.3.3 供試品溶液的制備

取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液作為丹參酮IIA的供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備

取除丹參之外的3味藥粗粉，按1/5處方量(約27 g)，精密稱取，加12倍量70%乙醇回流1.5 h，提取1次，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶，定容至刻度，即得陰性樣品溶液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取丹參酮IIA對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得丹參酮IIA回歸方程：Y=53.851X-10.197(R=0.999 8)。表明異補(bǔ)骨脂素濃度在7.20～72.00 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4 供試品含量測(cè)定

將1～9號(hào)供試品溶液和陰性樣品溶液分別用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣量10 μL，按上述補(bǔ)骨脂和丹參各自的色譜條件分別測(cè)定異補(bǔ)骨脂素、丹參酮IIA的含量，每項(xiàng)試驗(yàn)平行重復(fù) 3 次。

3 試驗(yàn)結(jié)果

采用兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，計(jì)算公式：分值=[(異補(bǔ)骨脂素含量/異補(bǔ)骨脂素含量最高值)×異補(bǔ)骨脂素權(quán)重系數(shù)+(丹參酮IIA含量/丹參酮IIA含量最高值×丹參酮IIA權(quán)重系數(shù)]×100,將異補(bǔ)骨脂素和丹參酮IIA權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.5，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

直觀分析表明，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，各因素影響作用主次順序?yàn)?C>A>B>D。方差分析(表3)表明，各因素對(duì)異補(bǔ)骨脂素和丹參酮IIA的含量均無顯著性影響(P>0.05)。通過直觀分析，綜合考慮，確定醇提組的最佳醇提工藝組合為A1B2C3D3，即分別為加12倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。

表3 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00。

4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定優(yōu)選工藝的可靠性,取3份醇提藥材，按最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得異補(bǔ)骨脂素和丹參酮IIA的含量分別為5.62、5.37、5.41 mg/g和2.17、2.24、2.11 mg/g。由此結(jié)果看出，在最佳提取工藝條件下，各考察指標(biāo)均能達(dá)到較高水平,所得優(yōu)選工藝得到驗(yàn)證。

5 討論

慢性心力衰竭是各種病因引起的心血管病的嚴(yán)重階段[1]，是心臟排血量不足，不能滿足機(jī)體組織代謝需要的病理狀態(tài)，屬中醫(yī)學(xué)心悸、水腫、喘證、痰飲和胸痹等癥的范疇[2-3]，古人認(rèn)為“久病及腎，久病多淤”[3]。

補(bǔ)腎活血湯由附子、補(bǔ)骨脂、山茱萸和丹參等10味藥組成。其中補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleaecorylifoliaL. 的干燥成熟果實(shí)[4]，主要含有香豆素類成分[5]，具有溫腎助陽功效[6]，治療心力衰竭的腎陽虛衰、血行不暢和血瘀[7]。丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[4]，化學(xué)成分取以丹參酮IIA為代表的脂溶性成分，具有抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗血栓等作用[8]。前期研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血湯能降低慢性心力衰竭患者室間隔厚度，降低慢性心力衰竭患者血漿腦鈉肽、內(nèi)皮素水平，可以明顯改善慢性心力衰竭患者心功能，改善血管內(nèi)皮功能，抑制心室重構(gòu)[1,9]。

前期預(yù)試驗(yàn)對(duì)因素水平進(jìn)行了單因素考察，結(jié)果顯示分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于90%、乙醇用量大于12倍、提取時(shí)間大于2 時(shí)，測(cè)得的有效成分含量相差不大，因此設(shè)定表1因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選。

本試驗(yàn)把處方中10味藥材依據(jù)理化性質(zhì)和藥理作用，對(duì)附子、補(bǔ)骨脂、山茱萸、丹參4味藥進(jìn)行乙醇提取工藝研究，選用臣藥補(bǔ)骨脂、丹參中有效成分含量為指標(biāo)，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，得出優(yōu)選提取方案為12倍量70%乙醇回流提取3次,每次1.5 h的提取工藝，為提高制成品有效成分含量、保證臨床療效提供了保證。

[1]李潔.補(bǔ)腎活血湯對(duì)慢性心力衰竭患者血漿腦鈉肽水平及血管內(nèi)皮功能的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012,10(10):1161-1162.

[2]李潔,安佰海,宋業(yè)琳.補(bǔ)腎活血法治療慢性心力衰竭探析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(9):2008-2009.

[3]安佰海,韓晶,解品啟,等.補(bǔ)腎活血湯對(duì)慢性心力衰竭患者長(zhǎng)正五聚蛋白3的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2015,13(1):11-13.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:76,187.

[5]陳雯,杜守穎,陸 洋.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選仙靈骨葆膠囊中丹參、補(bǔ)骨脂提取工藝[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(14):1792-1794.

[6]吳疆,魏巍,袁永兵.補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)評(píng)價(jià)研究,2011,34(3):217-219.

[7]李潔,唐明,宋業(yè)琳.補(bǔ)腎活血湯治療慢性心力衰竭的臨床觀察[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,7(4):341-316.

[8]李巧玉,劉 楊,包華音.近5年丹參化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2014,16(2):145-146.

[9]王常鴻.補(bǔ)腎活血湯治療腎虛血瘀型慢性心力衰竭的臨床研究[D]濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué),2013:11-15.

Extraction process optimization ofPsoraleaecorylifoliaL. andSalviamiltiorrhizaBge. from Bushen Huoxue Granule by orthogonal experiment

WANG Bing1, WANG You-feng1, LI Jing2*, WANG Yan2, ZHANG Wei2

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Qingdao City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qingdao 266033, China)

∶ We optimizedPsoraleaecorylifoliaL. andSalviamiltiorrhizaBge. extraction process of ethanol extraction group in Bushen Huoxue Granule. We also optimized ethanol concentration, ethanol dosage, extraction time and extraction times in extraction process with orthogonal experiment and contents of Isopsoralen inPsoraleaecorylifoliaand Tanshinone II A inSalviamiltiorrhizaas evaluation indexes. Experimental results show that optimum extraction conditions are 12 times 70% ethanol and three extraction times, one and a half hours per time. The extraction process is simple, reasonable, accurate and practicable, and provides necessary conditions for subsequent optimization of water extraction and granulation process.

∶ orthogonal experiment; isopsoralen; tanshinone IIA; extraction process; Bushen Huoxue Granule

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.007

2016-06-22

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2015-363)

王冰(1991—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┛刂茀^(qū)、中藥外用藥劑型。E-mail：wangbing7799@163.com

*通信作者，李靜(1972—)，女，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┛刂茀^(qū)、中藥外用藥劑型。E-mail：lijing9002@126.com

R284.2

A

1002-4026(2016)05-045-05