張 鵬

（遼寧省大連普蘭店市中心醫(yī)院骨二科，大連116200）

補腎壯骨方治療大鼠骨質疏松癥效果的實驗研究

張 鵬

（遼寧省大連普蘭店市中心醫(yī)院骨二科，大連116200）

目的通過運用自擬補腎壯骨方治療骨質疏松癥，觀察大鼠的體重、骨密度、骨生物力學等一般情況變化，并對血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標影響進行研究。方法采用SPF級雌性大鼠，80只，按體重進行分層隨機分為正常組、模型組、補腎壯骨方治療組、阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組。采用摘除卵巢對非正常組大鼠進行骨質疏松癥造模，正常組和模型組給予1 mL/100 g的生理鹽水，日2次，灌胃；補腎壯骨方治療組給予補腎壯骨中藥湯劑（1 mL/100 g，1 mL含1 g生藥），日2次，灌胃；阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組給予阿侖膦酸鈉溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg藥粉），日2次，灌胃。連續(xù)灌胃3個月。觀察大鼠股骨重量、骨密度變化、骨生物力學變化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3等指標變化。結果大鼠股骨重量骨密度變化；骨生物力學變化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標；實驗后，與正常組比較，模型組大鼠各項指標改變明顯（P＜0.05），差異具有統計學意義；補腎壯骨中藥治療組、阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組與模型組大鼠比較，均改善明顯（P＜0.05），補腎壯骨方治療組與阿侖膦酸鈉觀察組比較股骨重量（右側）、骨生物力學、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3變化明顯（P＜0.05），具有統計學意義，骨密度變化不明顯（P＞0.05），差異無統計學意義。結論補腎壯骨中藥治療骨質疏松癥模型大鼠效果明顯，能夠改善大鼠股骨重量、骨密度、骨生物力學、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等，通過多靶點、多途徑的促進骨細胞增殖，骨形成與重建，骨鈣磷代謝。

補腎壯骨方；骨質疏松癥；摘除卵巢大鼠骨質疏松癥模型；實驗研究

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是骨科臨床中常見的疾病，其病因復雜多樣，發(fā)病率較高，尤其中老年人發(fā)生率更高。隨著我國人口老年化的來臨，我國骨質疏松癥將迎來發(fā)生率的高峰[1]。西醫(yī)僅以補鈣作為主要治療方法，療效不佳。本研究通過運用自擬補腎壯骨方治療骨質疏松癥（摘除卵巢大鼠骨質疏松癥模型），觀察大鼠骨密度、骨生物力學變化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標水平的變化，報告如下：

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級，雌性大鼠，80只，體重(200± 20)g，遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXI（遼）ISO010-0001。

1.2 實驗藥物（1）補腎壯骨湯是由《十藥神書》中補髓丹和《活人心統》中的河車大造丸化裁而成，主要組成為豬骨髓30 g，紫河車20 g，阿膠20 g，牛膝15 g，杜仲15 g，熟地黃20 g，補骨脂15 g，淫羊藿15 g。所用中藥由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。將豬骨髓、紫河車、牛膝、杜仲、熟地黃、補骨脂、淫羊藿等中藥浸泡30 min，煎煮30 min后取湯，加水再次煎煮30 min，再次取湯，將兩次所取湯藥混合，加熱，濃縮，加入阿膠粉。所有制備中藥湯劑存放于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

（2）阿侖膦酸鈉（福善美）：片劑，杭州默沙東制藥有限公司生產，國藥準字：H20080073。

1.3 主要試劑及設備OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3檢測試劑盒(美國R&D公司，批號：201409）。無水乙醇、甲醛、戊巴比妥鈉等試劑，所有試劑由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。酶標儀(奧地利)型號：Anthos 2010；37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊醫(yī)療設備公司)型號:HXP-9052MBE；離心機(法國Jouan)型號:C4-12；微量移液器(美國熱電)；電子秤(上海精密儀器有限公司)型號:JY5022；雙能X線骨密度測定儀(美國GE公司）型號：LUNAR-Prodigy生物力學實驗機(美國MTS-858型)。

2 實驗方法

2.1 造模方法根據大鼠體重，取3%戊巴比妥鈉溶液進行腹腔注射，注射標準為0.2 ml/100 g。麻醉后進行卵巢摘取，全程無菌操作，于大鼠劍突下約1.5 cm處，沿腹白線進行縱向切割，切口約2 cm，剝離腹部肌肉及腹膜，充分暴露腹腔，確定子宮下角位置并向上找尋卵巢，結扎輸卵管及周圍血管組織，防止出血。正常組切除卵巢周圍脂肪組織，其他組摘除雙側卵巢。止血、縫合、并做好預防感染（術后肌肉注射20萬單位的青霉素，連續(xù)5天），擦涂云南白藥于手術切口。造模后觀察1周，期間自由飲水進食，一周后進行正式藥物實驗。

2.2 分組及處理采用SPF級雌性大鼠，80只，于通風、潔凈、安靜的環(huán)境下適應性喂養(yǎng)一周，期間自由飲水進食，一周后進行稱重。按體重進行分層隨機分為正常組、模型組、補腎壯骨方治療組、阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組，造模成功后進行正式實驗。正常組和模型組給予1 mL/100g的生理鹽水，日2次，灌胃；補腎壯骨方治療組給予補腎壯骨中藥湯劑（1 mL/100 g，1 mL含1 g生藥），日2次，灌胃；阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組給予阿侖膦酸鈉溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg藥粉），日2次，灌胃。連續(xù)灌胃3個月。

2.3 觀察指標股骨重量：實驗結束停藥24 h后，處死大鼠，摘取大鼠右側股骨，稱取重量。骨密度：采用雙能X線骨密度測定儀，對取材進行BMD分析。骨生物力學變化：應用MTS-858型生物力學實驗機進行骨生物力學的檢測。大鼠血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3：取大鼠股動脈血液5 mL左右，送往遼寧中醫(yī)藥大學血液檢測實驗室進行離心，分離血清和紅細胞，采用ELISA法進行血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3檢測。

2.5 統計分析采用SPSS17.0統計軟件處理，數據用均數±標準差（±s），兩組間數據比較采用單因素方差分析。

3 實驗結果

大鼠股骨重量骨密度變化；骨生物力學變化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指標，實驗后，與正常組比較，模型組大鼠各項指標改變明顯（P＜0.05），具有統計學意義；補腎壯骨中藥治療組、阿侖膦酸鈉陽性藥物觀察組與模型組大鼠比較，均改善明顯（P＜0.05），補腎壯骨方治療組與阿侖膦酸鈉觀察組比較股骨重量（右側）、骨生物力學、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3變化明顯（P＜0.05），具有統計學意義，骨密度變化不明顯（P＞0.05），差異無統計學意義。

3.1 股骨重量（右側）具體結果見表1。

表1 股骨（右側）指數變化

3.2 骨密度具體結果見表2。

表2 骨密度變化（±s）

表2 骨密度變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數股骨上端股骨下端正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 0.168±0.009 0.131±0.012△0.165±0.015☆0.165±0.011☆0.184±0.016 0.141±0.013△0.190±0.008☆0.185±0.019☆股骨全部0.147±0.013 0.126±0.018△0.153±0.013☆0.153±0.012☆

3.3 骨生物力學具體結果見表3。

表3 骨生物力學變化（±s）

表3 骨生物力學變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數最大載荷（N）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 135.03±4.71 83.06±5.03△130.05±4.70☆114.02±4.96☆剛度（N/mm）230.58±6.92 155.85±7.64△195.95±7.12☆177.78±8.21☆

3.4血清OCN、PICP的影響具體結果見表4。

表4 血清OCN、PICP變化（s）

表4 血清OCN、PICP變化（s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數OCN（ng/ml）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 6.412±1.031 4.053±1.132△6.351±1.011☆6.741±0.993☆PICP（ng/ml）9.655±0.899 8.249±0.959△9.901±0.791☆9.255±0.949☆

3.5 血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3的影響具體結果見表4。

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3變化（±s）

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3變化（±s）

注：△表示與正常組比較P＜0.05；☆表示與模型組比較P＜0.05

組別例數25(OH)D3（ng/L）正常組模型組中藥組西藥組19 20 19 20 429.88±15.45 415.07±23.01 447.22±39.87 439.04±20.55 1,25(OH)2D3（ng/ml）586.32±38.19 493.99±55.01▲604.03±42.99★590.11±36.74★

4 討論

本研究結果表明：①股骨重量（右側）提示補腎壯骨方具有補腎生精壯骨的作用，能夠充實腎臟，壯實股骨。腎主骨，補腎壯骨方中還有補腎中藥，故腎氣與腎精充盛，精能生髓，髓能壯骨，腎精盛則股骨壯。②骨密度的檢測能夠充分反映機體內骨礦物的含量，直接、客觀的判斷藥物療效[2]。補腎壯骨湯能夠增加機體內骨礦物質的含量，增加機體內鈣質的含量。③骨生物力學為評價骨質量的重要指標，能夠充分反映骨質量的水平。摘除大鼠雙側卵巢后，性激素生成代謝紊亂，膠原纖維的合成減少，骨形成能力下降，骨力學強度下降、脆性上升，易發(fā)骨折[3]。補腎壯骨湯治療組效果顯著，可能參與抑制骨吸收、促進骨增殖、增加膠原蛋白。④OCN是一種非膠原蛋白質激素樣多肽，是非增殖期成骨細胞合成分泌的，其水平和骨組織水平呈正相關關系，能夠直接反應骨細胞的活性和相關代謝變化[4]。阿侖膦酸鈉陽性藥物對照組與補腎壯骨湯能夠影響機體骨細胞的改變和鈣的代謝，改善骨骼發(fā)育。⑤PICP能夠反映OP病理改變、療效機制、診斷疾病、判斷疾病發(fā)展等[5]。補腎壯骨湯能夠改善PICP的水平，提高骨細胞活性，促進骨形成，抑制破骨細胞，從而達到抗OP的效果。⑥25-(OH)D3水平能夠準確反映機體內維生素D的水平，25-(OH)D3也和BMD呈正相關關系[6]。⑦1，25-(OH)2D3是腎臟近端腎小管內經過25-(OH)D-1α-羥化酶的又一次轉化形成的[7]。另外胎盤和巨噬細胞也能夠合成少量的1，25-(OH)2D3[8]。1，25-(OH)2D3能夠同時調節(jié)成骨細胞和破骨細胞，同時參與骨形成和骨代謝的兩個變化，對骨具有雙向調節(jié)功用，若其發(fā)生改變造成骨吸收的增多則平衡破壞，發(fā)生OP。補腎壯骨湯能夠通過調節(jié)血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3水平，改善機體體內骨形成與吸收的平衡，達到治療目的。

綜上所述，《十藥神書》中補髓丹和《活人心統》中的河車大造丸化裁而成的自擬補腎壯骨湯能夠改善骨質疏松大鼠各項指標，從不同角度、不同途徑起到治療作用，值得應用于臨床。

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Experimental Study on the Effect of Bushen Zhuanggu Decoction in the Treatment of Osteoporosis Rats

ZHANG Peng
(Department of Orthopedics,Pulandian Central Hospital,Liaoning Province,Dalian 116200,China)

Objective By using self-made Bushen Zhuanggu decoction in the treatment of osteoporosis,to observe generally changes of rats weight,bone mineral density,bone biomechanics,and to study the indexes of Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3etc.Methods 80 female rats of SPF,according to body weight,were randomized to normal group,model group,Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate sodium positive drug observation group.The introduction of ovariectomized rats in the non normal group of osteoporosis rats,normal group and model group were given physiological saline 1ml/ 100g,2 times a day,gavage.Bushen Zhuanggu decoction treatment group was given Bushen Zhuanggu Chinese medicine decoction (1ml/100g,1ml contains 1g crude drug),2 times a day,gavage.Alun phosphonic acid sodium positive drug observation group was treated with alendronate sodium solution(1ml/100g,1ml contains 0.74mg powder),2 times a day,gastric lavage.The treatment continued irrigation for 3 months.The changes of the weight,bone mineral density,bone biomechanical changes,serum OCN,PICP, 25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3and other indexes in rats were observed.Results The changes of rat femur weight bone density,bone biomechanics,serum OCN,PICP,25-(OH)D31,25-(OH)2D3index after experiment were compared with the normal group,the indexes of model group rats changed significantly(P＜0.05),and there was statistical significance.The Bushen Zhuanggu treatment group and the alendronate positive drug observation group was compared with the model group,and the improvement was significant (P＜0.05).Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate observation group was compared the weight of femur (right),bone biomechanics,serum OCN,serum PICP,25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3,changes were significant(P＜0.05),and there was statistical significance,but bone density did not change significantly(P＞0.05),there was no statistical significance. Conclusion The Bushen Zhuanggu Chinese medicine in the treatment of osteoporosis model rats has obvious effect,can improve the rat bone weight,bone density,bone biomechanics,Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3,through multiple targets and multiple ways to promote the proliferation of bone cells,bone formation and reconstruction,bone calcium and phosphorus metabolism.

Bushen Zhuanggu decoction;osteoporosis;ovariectomized rat model of osteoporosis;experimental study

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.066

1672-2779（2016）-24-0145-03

張文娟本文校對：侯長福

2016-08-11）