宋興華 賴毛華 劉 華 葉振宇 夏鑫華

（廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣州510120）

健脾補腎法對骨髓抑制小鼠造血功能的影響※

宋興華 賴毛華 劉 華 葉振宇 夏鑫華

（廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣州510120）

目的探討健脾補腎法對骨髓抑制小鼠造血功能的影響。方法取BALB/c小鼠60只，按照體重將60只雄性小鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組、健脾補腎法組，每組15只。模型組、陽性對照組、健脾補腎法組小鼠按照0.1 mL/10 g體重腹腔注射8 mg/mL環(huán)磷酰胺溶液（劑量為80 mg/kg），正常對照組小鼠按照0.1 mL/10 g體重腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，每天1次，連續(xù)3天。確定小鼠造模成功后，健脾補腎法組小鼠每日上下午分別按照0.2 mL/10 g體重灌胃給予2 g/mL健脾補腎方及龜鹿二仙丹，陽性對照組小鼠每日按照0.1 mL/10g體重腹腔注射12.5 μg/mL rhG-CSF，每天1次，連續(xù)給藥7天。正常對照組和模型組均按照0.2 mL/10 g體重灌胃給予純凈水。末次給藥后24 h，經小鼠眼球后靜脈叢采血，用裝有EDTA-Na抗凝劑的采血管收集，用全自動血細胞分析儀進行白細胞檢測。頸椎脫臼處死各組小鼠，檢測骨髓造血細胞集落形成和骨髓有核細胞的情況。結果健脾補腎法具有促使骨髓抑制小鼠骨髓細胞解除Go/G1期阻滯、促使Go/G1期細胞向S期細胞以及加速S期細胞向G2/M期細胞轉化，從而促進骨髓細胞增殖的作用。結論健脾補腎法對化療后所致骨髓抑制有顯著的改善和恢復作用。

健脾補腎法；骨髓抑制；實驗研究；虛勞

目前化學治療仍是惡性腫瘤治療的主要手段之一，臨床上大多數(shù)化療藥物可導致有不同程度的骨髓抑制，這既降低患者的生存質量，又影響了抗癌治療，有的患者不得不因此而中途停藥，有的甚至危及生命。因此，如何預防和減輕化療導致的骨髓抑制，促進骨髓造血功能恢復，升高外周血白細胞和血小板，已成為保證化療順利完成，提高臨床療效的關鍵問題。中醫(yī)學多將化療后骨髓抑制歸于脾腎兩虛、氣血不足，臨床多以益氣補血為主要的治療方法，但療效還不盡理想。筆者在多年臨床實踐中體會到健脾補腎法效果會更好，但其作用機制不明，相關的實驗研究報道較少。本實驗觀察了健脾補腎法對環(huán)磷酰胺誘發(fā)骨髓抑制的影響，并對其作用機理作了初步探討。

1 材料及儀器

1.1 動物BALB/c小鼠，SPF級；60只，雄性；體重：18.1～22.0 g；實驗動物質量合格證明號：44007200015247。實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

1.2主要試劑與儀器主要儀器：JEA3001系列電子天平：精度0.1 g，上海浦春計量儀器有限公司；7020型全自動生化儀，HITACHI公司產品；BD AccuriC6流式細胞，美國BD公司產品。

主要試劑：細胞周期試劑盒，批號20131050，有效期至20161004，上海七海復泰生物科技有限公司產品；氫氧化鉀，批號130227，有效期至20180226，廣州市中南化工儀器有限公司產品；甲醇，批號141006，有效期至20171005，廣州市中南化工儀器有限公司產品。

1.3 中藥治療

1.3.1 健脾補腎方黃芪50 g，女貞子15 g，黨參15 g，淮山藥15 g，茯苓15 g，白術15 g，桑椹15 g，菟絲子15 g，黃精30 g，雞血藤60 g，淫羊藿15 g，肉蓯蓉15 g，山萸肉15 g。將上述藥材混勻，浸泡1小時，煎煮2次，加水量分別為藥材量的10倍、6倍；煎煮時間分別為1.5 h、1 h，合并二次水煎液，過濾，濾液，濃縮成含生藥2 g/mL的藥液。

1.3.2 龜鹿二仙丹加味生龜甲50 g（先煎），鹿角霜15 g（烊化），阿膠15 g（烊化），枸杞子15 g，西洋參15 g，沙參30 g。將上述藥材混勻，浸泡1小時，煎煮2次，加水量分別為藥材量的10倍、6倍；煎煮時間分別為1.5 h、1 h，合并二次水煎液，過濾，濾液，濃縮成含生藥2 g/mL的藥液。

1.4 研究方法

1.4.1 模型制作模型組、陽性對照組、健脾補腎法組小鼠按照0.1 mL/10 g體重腹腔注射8 mg/mL環(huán)磷酰胺溶液（劑量為80 mg/kg），正常對照組小鼠按照0.1 mL/10 g體重腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，每天1次，連續(xù)3天。造模結束后24 h，每組隨機選取5只小鼠，眼球后靜脈叢采血，用全自動血細胞分析儀進行白細胞（WBC）檢測，以和正常對照組比較，WBC顯著降低為模型成功標準。

1.4.2 分組及給藥方法按照體重將60只雄性小鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組、健脾補腎法組，每組15只。確定小鼠造模成功后，健脾補腎法組小鼠每日上下午分別按照0.2 mL/10 g體重灌胃給予2 g/ mL健脾補腎方及龜鹿二仙丹，陽性對照組小鼠每日按照0.1 mL/10g體重腹腔注射12.5 μg/mL rhG-CSF，每天1次，連續(xù)給藥7天。正常對照組和模型組均按照0.2 mL/10 g體重灌胃給予純凈水。

1.4.3 外周血白細胞計數(shù)末次給藥后24 h，經小鼠眼球后靜脈叢采血，用裝有EDTA-Na抗凝劑的采血管收集，用全自動血細胞分析儀進行白細胞檢測。

1.5 細胞周期樣品制備及分析細胞周期樣品制備：末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死各組小鼠，取出股骨，用6號針頭以1 mL PBS沖出骨髓細胞，200目篩網(wǎng)過濾制成單個骨髓細胞懸液。將單個骨髓細胞懸液1000 r/ min離心5 min，去上清液，用預冷PBS洗滌2次，棄上清液，加入70%預冷乙醇固定打散細胞，4℃保存待檢。按文獻方法，進行細胞周期分析

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析；實驗結果的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示；方差齊，采用方差分析，用多個實驗組和對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。

2 結果

2.1 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠外周血白細胞數(shù)量的影響（見表1）

表1 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠白細胞數(shù)量的影響（±s，♂）

表1 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠白細胞數(shù)量的影響（±s，♂）

組別例數(shù)劑量WBC（109/L）正常對照組10-5.4±0.6模型組10-2.9±0.4**陽性對照組10125 μg·kg-1·d-15.0±0.6△△健脾補腎法組1040 g·kg-1·d-14.6±0.4**△△

采用方差分析，與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。與正常對照組比較，模型組、健脾補腎法組的小鼠外周血WBC數(shù)量極顯著下降（P＜0.01），陽性對照組的小鼠外周血WBC數(shù)量有所下降，但未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與模型組比較，陽性組和健脾補腎法組的小鼠外周血WBC數(shù)量極顯著上升（P＜0.01）。提示，藥物治療對骨髓抑制小鼠的白細胞數(shù)量的提高有一定影響。

2.2 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期變化的影響（見表2）

表2 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期的影響（±s，♂）

表2 健脾補腎法對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期的影響（±s，♂）

注：G0/G1、S、PI采用秩和檢驗，G2/M采用方差分析，與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別例數(shù)劑量正常對照組10-G0/G1（%）72.16±1.48模型組10-陽性對照組10125 μg·kg-1·d-185.68±1.75**77.36±3.99△△健脾補腎法組1040 g·kg-1·d-179.50±2.23*S（%）15.42±1.76 5.55±1.77**12.02±4.80△△8.21±1.49*G2/M（%）8.22±2.21 7.15±2.07 7.82±1.60 9.44±1.0△△PI（%）24.65±2.09 12.90±1.83**20.35±4.97△△18.18±1.47△

與正常對照組比較，模型組骨髓有核細胞G0/G1期細胞比例極顯著升高（P＜0.01），S期細胞比例極顯著下降（P＜0.01），G2/M期細胞比例下降（P＞0.05），細胞增殖指數(shù)極顯著下降（P＜0.01）；陽性對照組骨髓有核細胞G0/G1期細胞比例升高（P＞0.05），S期、G2/M期細胞比例和細胞增殖指數(shù)下降（P＞0.05）；健脾補腎法組骨髓有核細胞G0/G1期細胞比例顯著升高（P＜0.05），S期細胞比例顯著下降（P＜0.05），G2/M期細胞比例升高（P＞0.05），細胞增殖指數(shù)下降（P＞0.05）。

與模型對照組比較，陽性對照組骨髓有核細胞G0/ G1期細胞比例極顯著下降（P＜0.01），S期細胞比例極顯著上升（P＜0.01）、G2/M期細胞比例升高（P＞0.05），細胞增殖指數(shù)極顯著上升（P＜0.01）；健脾補腎法組骨髓有核細胞G0/G1期細胞比例下降（P＞0.05），S期細胞比例上升（P＞0.05），G2/M期細胞比例極顯著升高（P＜0.01），細胞增殖指數(shù)顯著上升（P＜0.05）。

以上結果提示，健脾補腎法具有促使骨髓抑制小鼠骨髓細胞解除G0/G1期阻滯、促使G0/G1期細胞向S期細胞以及加速S期細胞向G2/M期細胞轉化，從而促進骨髓細胞增殖的作用。

3 討論

骨髓是人體重要的造血器官，骨髓產生的造血干細胞經過分化生成紅細胞、白細胞、血小板、淋巴細胞等各種血細胞而發(fā)揮生理功能。骨髓對化療藥物及放射物質的高度敏感，當骨髓暴露在化療藥物及射線下時，骨髓會在細胞、分子水平上發(fā)生形態(tài)、數(shù)量以及生化等多方面的病理改變，從而造成各種骨髓有核細胞及外周血細胞數(shù)量減少、DNA斷裂、染色體畸變、造血細胞功能障礙甚至細胞壞死，具體表現(xiàn)為骨髓有核細胞數(shù)量、DNA含量、白細胞數(shù)量下降及微核細胞率增加等改變[1]。

骨髓抑制癥，中醫(yī)并無此病名，但根據(jù)化療后臨床所出現(xiàn)癥狀如頭暈乏力、腰膝酸軟、惡心嘔吐、納差、心悸、五心煩熱、寐差多夢、易外感發(fā)熱及出血等癥狀，大多將其歸為中醫(yī)“血虛”“虛勞”范疇。中醫(yī)學認為，藥物毒邪導致氣血俱虛、陰陽失和、臟腑虧損，其發(fā)生與心、肝、脾、腎等臟有關，尤其與脾腎關系最為密切[2-3]。對1989年以來相關文獻研究結果表明，認為病位在脾者占83.78%，在腎者占70.27%，在脾腎者占89.19%。與肺、肝亦有一定相關性[4]。脾虛生化乏源，傷及腎本，髓失所養(yǎng)不能藏精化血，不能補骨生髓、藏精化血。所以益氣健脾、補腎生髓為主要治療原則。

本研究中基本方黃芪、女貞子、黨參或太子參、淮山藥、茯苓、白術、桑椹、菟絲子、黃精、雞血藤、淫羊藿、肉蓯蓉、山萸肉共奏健脾益腎之功。并重用血肉有情之品增強補腎生髓之功。氣血不足，陰精陽氣虧虛，進一步發(fā)展而致陰陽受損，使氣血陰陽俱虛，此為骨髓抑制發(fā)生之根本，貫穿病癥之始終；《內經》云“精不足者，補之以味”，是指對陰精不足者采用滋膩厚重、血肉有情之品以填精補陰；《臨證指南醫(yī)案》云“夫精血皆有形，以草木無情之物為補益，聲氣必不相應”。

本實驗中小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后骨髓有核細胞數(shù)量和DNA含量明顯降低，說明環(huán)磷酰胺已對骨髓造成了急性損傷。各種血細胞對化療藥物的敏感性取決于它們的半衰期長短。白細胞半衰期最短6 h，故最易受到抑制，引起白細胞減少；在本實驗中，環(huán)磷酰胺顯著降低了模型小鼠外周血白細胞。應用健脾補腎藥顯著升高了模型小鼠白細胞的數(shù)量，表明健脾補腎法對促進造血干細胞的增殖分化有一定的作用。

細胞在周期各個時相的分布情況可以反映細胞增殖的狀態(tài)，對于骨髓細胞來說，它亦是反映造血系統(tǒng)造血功能的重要指標之一[5]。在細胞周期調控中有兩個重要的監(jiān)測點，分別位于G1與S期和G2與M期之間。研究表明，細胞周期中，G2/M期對化療的敏感性最強，其次是Go/G1期，S期對化療藥物敏感性最低?；熢斐稍煅毎鸇NA損傷后，激活細胞周期監(jiān)測點機制，將細胞周期阻滯于G1期修復損傷DNA，對不能修復者啟動凋亡程序消除受損細胞[6]。本實驗中，腹腔注射環(huán)磷酰胺后模型組Go/G1細胞百分比顯著高于空白對照組，G2/M期細胞百分比和增殖指數(shù)顯著低于空白對照組，表明環(huán)磷酰胺可以引起G1期阻滯，進而造成S期阻滯，并通過促進細胞凋亡而導致骨髓抑制。與模型組比較，健脾補腎方組Go/G1期細胞百分比顯著下降，G2/ M期細胞百分比顯著增加，增殖指數(shù)提高，表明使用健脾補腎法可能通過修復損傷的DNA，解除細胞周期阻滯，使受阻滯的各期細胞加速通過G1/S和S期監(jiān)測點。

綜上所述，本實驗結果提示健脾補腎法對化療后所致骨髓抑制有顯著的改善和恢復作用。

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Influence of Jianpi Bushen Recipe on the Blood-pProdhcing Function in Mice of Myelosuppression

SONG Xinghua,LAI Maohua,LIU Hua,YE Zhengyu,XIA Xinhua
(Department of TCM,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,China)

Objective To discuss the influence of Jianpi Bushen recipe on the blood-prodhcing function in mice of myelosuppression induced by cyclophosphamide.Methods Taking BALB/c mice 60 cases,according to the weight,60 male mice were randomly divided into normal control group,model group,positive control group and Jianpi Bushen recipe group,with 15 cases in each group.The model group,the positive control group and Jianpi Bushen recipe group were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/10 g weight 8 mg/mL solution cyclophosphamide(dose of 80 mg/kg).The normal control group mice was given intraperitoneal injection of 0.1 mL /10 g weight 0.9%sodium chloride injection,1 time a day for three days.After the success of the building,the mice in Jianpi Bushen recipe group were given daily 0.2 mL/10 g,weight lavage for 2 g/mL Jianpi Bushen recipe gr and Guilu Erxian minipills in the morning and afternoon.The positive control group mice were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/10 g weight 12.5 mu g/mL rhG CSF,1 time a day for seven days.The normal control group and model group were in accordance with 0.2 mL/10 g weight to fill the stomach to pure water.The last 24 h after the treatment,venous plexus after eyeball in mice blood,usedh EDTA-Na anticoagulant blood vessels of the adopt of collection,white blood cell detection using automatic blood cell analyzer.Cervical dislocation execution groups of mice,detection of bone marrow hematopoietic cell colony formation and bone marrow nucleated cells.Results Jianpi Bushen recipe method have prompted bone marrow inhibition of mouse bone marrow cells remove Go/G1phase retardation,prompted Go/G1phase to S phase cells,and accelerated the S phase cells to the G2/M phase transformation,so as to promote the role of bone marrow cell proliferation.Conclusion Jianpi Bushen recipe can significantly improve and restore function of bone marrow suppression after chemotherapy.

Jianpi Bushen recipe;myelosuppression;experimental study;consumptive disease

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.064

1672-2779（2016）-24-0140-03

張文娟本文校對：范萍

2016-07-05）

廣州市衛(wèi)生局立項項目（No：20132A011024）