■王 敬鄧 陽王梓卓吳國江*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)國土資源學(xué)院，河北保定071000）

肝臟是動物機體進行物質(zhì)和能量代謝的主要場所，外源性化學(xué)藥物進入機體后，需經(jīng)肝生物轉(zhuǎn)化降解以降低其毒副作用，減少對機體損傷，但若長期或大量服用化學(xué)性藥物，勢必造成藥物在肝內(nèi)沉積并對肝臟造成損傷，致使動物疾病頻發(fā)，進而造成死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，同時殘留的化學(xué)藥物也會通過食物鏈直接或間接給人類健康帶來的危害，從而引發(fā)諸多的食品安全問題。

三磷酸腺苷（ATP）是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動所需能量的直接來源。肝功能受損，肝細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)出現(xiàn)受抑，導(dǎo)致肝內(nèi)ATP水平下降[1]，進而造成蛋白質(zhì)等合成受阻，影響機體正常的生命活動，所以對肝損傷機體及時補充ATP在一定程度上可以緩解機體細(xì)胞損傷進程，降低死亡率。但ATP只能臨時補充體內(nèi)缺乏的能量物質(zhì)，對已損傷肝細(xì)胞無法進行修復(fù)，所以在補充ATP的同時，還需消除肝損傷因素，及時保護或修復(fù)受損肝細(xì)胞。大量試驗證實[2]，水飛薊素是護肝活性最高、最有效的物質(zhì)，具有清除自由基[3]、抑制脂質(zhì)過氧化[4]、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜[5]的作用，從而減輕肝細(xì)胞損傷[6]、促進肝細(xì)胞的修復(fù)和再生[7]。

本研究以小鼠為試驗動物，將水飛薊素與ATP按照單方使用劑量聯(lián)用，通過考察ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALB等指標(biāo)，以及切片觀察，探討水飛薊素與ATP聯(lián)用對化學(xué)性藥物肝細(xì)胞保護及受損細(xì)胞修復(fù)效果，為養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常發(fā)生的肝病防治提供適宜藥物和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物

健康成年清潔級SPF昆明小鼠[(18～22)g]70只，雌、雄各半。由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供（11401500008918）。

1.2 試驗藥品

水飛薊素，購自盤錦德潤生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、總蛋白（TP）測定試劑盒、白蛋白(ALB)測定試劑盒，均購自中生北控生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；四氯化碳（CCl4）分析純，購自天津市北方化玻購銷中心；三磷酸腺苷購自國藥集團榮生制藥有限公司。

1.3 試驗儀器

電子調(diào)溫萬用電爐（型號為DK-98-Ⅱ），購自上海亞榮生化儀器廠。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號為RE-52A），購自上海亞榮生化儀器廠。紫外-可見分光光度計（型號為752型），購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。普通型離心機（型號為LDZ-52），購自北京離心機廠。數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號為HH-4），購自金壇市華特試驗儀器有限公司。電子天平（型號為JA2103），購自金壇市華特試驗儀器有限公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號為DHG-9240A），購自上海飛越試驗儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 小白鼠預(yù)飼

將70只小白鼠在常溫下，自由飲食7 d，待動物適應(yīng)后，依試驗分為空白組(Ⅰ組)和受試組(6組)，其中空白組(10只)飼喂蒸餾水(0.2 ml/只)，其余各組(10只/組，共60只)分別均灌胃30%CCl4溶液(0.2 ml/只)，給藥3 d后依據(jù)以血清轉(zhuǎn)氨酶（AST和ALT）、肝組織指標(biāo)(SOD和GSH)和病理切片進行分析評價，確定造模成功。

2.2 試驗動物的分組及給藥劑量

試驗造模成功后，將各受試組隨機分為模型對照組（Ⅱ組）、ATP組（Ⅲ組）、水飛薊素組（Ⅳ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP低劑量組（Ⅴ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP中劑量組（Ⅵ組）、水飛薊素聯(lián)合ATP高劑量組（Ⅶ組）及空白對照組（Ⅰ組），共7組，每組10只小鼠，其中空白對照組（15 ml/kg），ATP組（15 ml/kg，其中ATP 0.6 mg/ml）；水飛薊素組（15 ml/kg，其中水飛薊素2.06 mg/ml）；水飛薊素聯(lián)合ATP低劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素2.06 mg/ml，ATP 0.6 mg/ml）；Ⅵ組水飛薊素聯(lián)合 ATP中劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素4.12 mg/ml，ATP 1.2 mg/ml）；Ⅶ組水飛薊素聯(lián)合ATP高劑量組（15 ml/kg，其中水飛薊素8.24 mg/ml，ATP 2.4 mg/ml），共給藥7 d。試驗結(jié)束后，采用摘除眼球方法取血進行試驗研究。

3 水飛薊素聯(lián)合ATP的使用對CCl4所致肝損傷的作用效果研究

3.1 采血

3.1.1 血清的制備

給藥結(jié)束后于第8 d采用摘除眼球取血方法，將采到的血于3 500 r/min離心l0 min分離血清，4℃保存待測。

3.1.2 肝勻漿的制備

剪取0.6 g肝組織，加入5.4 ml的生理鹽水充分研磨，立即制成10%的肝勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液備用。

3.2 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細(xì)胞修復(fù)程度的測定

血清中所檢測的ALT和AST活性的高低反映了細(xì)胞的損傷程度，而蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多少則反映出肝臟的功能是否恢復(fù)，因此，試驗通過檢測小鼠血清中ALT和AST活性的多少來反映藥物對小鼠肝細(xì)胞損傷的修復(fù)程度，對ALB和TP的含量的檢測來反映肝臟功能恢復(fù)的程度。操作方法按照ALT、AST、ALB和GTP試劑盒的操作步驟進行。

3.3 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細(xì)胞損傷保護程度的測定

SOD和GSH為肝臟中的還原性物質(zhì)，能夠與肝臟中的自由基反應(yīng)從而保護肝臟細(xì)胞免于自由基的損傷。因此，試驗用檢測肝臟中SOD和GSH的活性來觀察藥物對小鼠肝臟的保護作用。操作方法按照SOD和GSH試劑盒的操作步驟進行。

3.4 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響

用HE染色石蠟切片，采用光學(xué)顯微鏡對封固好的切片進行觀察，并連接電腦進行拍照。

3.5 試驗數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進行方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

4 結(jié)果

4.1 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細(xì)胞修復(fù)程度的作用效果（見表1、表2）

表1 小鼠血清中AST、ALT的活性測定結(jié)果(x±s)

表2 小鼠血清中ALB、TP含量測定結(jié)果（x±s）

由表1可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的AST和ALT的活性極顯著升高（P＜0.01），說明試驗造模成功；與Ⅱ組相比，各試驗組AST和ALT活性極顯著降低（P＜0.01），說明各藥物均對AST和ALT活性的升高有較好的抑制作用；但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組相比AST和ALT活性的差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組的AST和ALT與Ⅰ組相比差異不顯著（P＞0.05），說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的AST和ALT活性降低且接近恢復(fù)正常狀態(tài)。

由表2可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組ALB的含量極顯著降低（P＜0.01），TP的含量極顯著升高（P＜0.01），表明CCl4模型試驗成功；與Ⅱ組相比，各試驗組ALB的含量極顯著升高（P＜0.01），TP含量極顯著降低（P＜0.01），說明各藥物均可以使ALB的含量升高，使TP降低。但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組的ALB和TP含量相比差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組與Ⅰ組的ALB和TP含量相比差異不顯著（P＞0.05），說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的ALB含量升高、TP含量降低且接近恢復(fù)正常狀態(tài)。

4.2 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝細(xì)胞損傷保護程度的作用效果（見表3）

由表3可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組的SOD和GSH的活性極顯著降低（P＜0.01），說明試驗造模成功；各試驗組與Ⅱ組比較SOD活性和GSH的活性極顯著升高（P＜0.01），說明各藥物組均可以使SOD和GSH的活性升高；但Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅰ組的SOD和GSH活性相比差異極顯著（P＜0.01），Ⅵ組、Ⅶ組與Ⅰ組的SOD和GSH活性相比差異不顯著（P＞0.05）說明Ⅵ組、Ⅶ組的藥物能夠使小鼠的SOD和GSH活性升高且接近恢復(fù)正常狀態(tài)。

表3 小鼠血清中SOD、GSH活性測定結(jié)果（x±s）

4.3 水飛薊素聯(lián)合ATP對小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響（見圖1）

圖1 小鼠肝臟病理切片

由圖1可見，正常組小鼠肝索排列正常，放大倍數(shù)可觀察到無炎性細(xì)胞浸潤和壞死，模型對照組小鼠，肝索紋理不清晰，高倍鏡下可看到炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，說明試驗造模成功。當(dāng)給小鼠灌胃水飛薊素聯(lián)用ATP的中、高劑量時可觀察到肝索排列基本正常，高倍鏡下細(xì)胞的炎性浸潤減輕，細(xì)胞死亡數(shù)明顯減少，與空白組接近。

5 討論

化學(xué)藥物性肝損傷在養(yǎng)殖業(yè)中屬于常見的多發(fā)病。發(fā)病初期的動物主要表現(xiàn)為消化不良、食欲不振。若不及時治療則會使動物出現(xiàn)肝炎、肝硬化甚至是死亡[8]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前，對于化學(xué)藥物性肝損傷的治療大多數(shù)為西藥制品，然而西藥往往在治療肝病的同時會產(chǎn)生極大的副作用[9]，損傷其他器官，因此，不能從根本上解決化學(xué)藥物性肝損傷的問題。試驗摒棄了西藥的弊端，使用傳統(tǒng)的保肝類中藥水飛薊素[10]，并在其基礎(chǔ)上添加ATP，保證了在治療化學(xué)藥物性肝損傷時及時為受損的肝細(xì)胞進行能量補充，緩解機體細(xì)胞損傷[11]。二者聯(lián)用，相輔相成，最終達(dá)到解決化學(xué)藥物性肝損傷的目的。

化學(xué)性藥物對肝損傷因子，主要側(cè)重于自由基?；瘜W(xué)藥物在酶CYP2E1的作用下產(chǎn)生的自由基即可與蛋白質(zhì)中的巰基共價結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能發(fā)生障礙[12]，也可與氧結(jié)合生成過氧化物使脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)[13]，同時自由基還可破壞細(xì)胞膜并直接攻擊線粒體和DNA，影響能量和DNA的合成[14]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死進而引發(fā)整個肝臟功能障礙，使動物出現(xiàn)消化不良、食欲不振等癥狀[15]。Recknagel等[16]通過試驗證實，機體中的還原性物質(zhì)SOD（超氧化物歧化酶）和GSH（還原型谷胱甘肽）能與自由基結(jié)合成結(jié)合物，從而降低對肝臟的損傷。因此，在飼料中添加能夠促進機體內(nèi)還原物質(zhì)釋放或使受損的細(xì)胞恢復(fù)產(chǎn)生還原性物質(zhì)功能的保肝藥物可在一定程度上降低對動物肝臟的損害。

SOD和GSH能夠與自由基反應(yīng)[17]，從而降低自由基對肝細(xì)胞的損傷作用，當(dāng)二者含量降低時會導(dǎo)致過量的自由基不能夠被清除而引發(fā)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞的壞死。試驗結(jié)果顯示，小鼠在灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量后SOD和GSH的活性升高，且與四氯化碳組比較差異極顯著（P＜0.01），與空白組比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在提高SOD和GSH活性的方面有很好的的作用[18]，能夠在一定程度上緩解由自由基引起的脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞的壞死；化學(xué)藥物性肝損傷除了引發(fā)自由基，造成肝細(xì)胞損傷外，還可造成血清中AST和ALT[19]活性的變化。AST和ALT[19]存在于細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)細(xì)胞膜受損時，位于胞漿中的AST和ALT外流，導(dǎo)致血清中的AST和ALT的活性升高。因此，檢測血清中AST和ALT活性，可直接反映細(xì)胞膜的損傷程度。試驗證實，中、高劑量水飛薊素與ATP聯(lián)用后小鼠血清中AST和ALT的活性降低且與四氯化碳組相比差異極顯著（P＜0.01），與空白組相比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在一定程度上能夠降低細(xì)胞膜的損傷，從而抑制胞漿中AST和ALT的外流，使血清中AST和ALT活性降低。

白蛋白(ALB)、總蛋白（TP）只有在肝臟中才能夠合成，其水平的高低是檢測肝損傷的標(biāo)志性指標(biāo)之一[20]，若ALB的含量降低，TP的含量升高則會導(dǎo)致急慢肝炎的發(fā)生。試驗結(jié)果顯示，小鼠在灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量藥物后ALB的含量升高，TP的含量降低，且與四氯化碳組相比差異極顯著（P＜0.01），與空白組比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥物在提高ALB和降低TP的含量的方面有很好的作用，能夠在一定程度上緩解急慢性肝炎的發(fā)生。從試驗切片也能看出，四氯化碳模型對照組，小鼠肝索紋理不清晰，有炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞組織壞死灶，而灌胃水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量組的小鼠，肝索排列基本正常，細(xì)胞炎性浸潤減輕，死亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，與空白組接近，說明水飛薊素聯(lián)合ATP中、高劑量組的藥物對小鼠肝損傷有一定的緩解作用。

試驗證實，聯(lián)合應(yīng)用水飛薊素和ATP中、高劑量，可以較好緩解化學(xué)藥物性肝損傷的問題，使肝臟恢復(fù)生產(chǎn)SOD和GSH的能力，降低自由基對肝臟細(xì)胞的損傷，使肝臟恢復(fù)正常功能，抑制化學(xué)藥物性肝損傷的進一步發(fā)展，為養(yǎng)殖業(yè)解決化學(xué)性藥物肝損傷提供理論和試驗依據(jù)。