■ 趙 偉 王寶杰 劉 梅 蔣克勇 齊燦燦 楊 廣* 王 雷

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384；2.中國科學(xué)院海洋研究所中國科學(xué)院實驗海洋生物學(xué)重點實驗室，山東青島266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室，山東青島266071）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）于20世紀(jì)80年代末由南美洲引入我國后，現(xiàn)在在各沿海及內(nèi)陸和鹽堿地養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已成為當(dāng)前我國對蝦養(yǎng)殖的最主要品種和我國水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟的重要支柱產(chǎn)業(yè)。隨著集約化養(yǎng)殖程度的增加，對配合飼料的需求也在日益增加，使得對蝦飼料工業(yè)迅猛發(fā)展。飼料主要原料有棉籽粕、小麥、花生粕、玉米、豆粕和魚粉等，這些原料在生產(chǎn)、儲存、運輸過程中易發(fā)生霉變，據(jù)報道世界上每年大約有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，造成了巨大的經(jīng)濟損失。

黃曲霉毒素是一類二呋喃香豆素衍生物，被國際癌癥研究機構(gòu)分類為I類致癌物，在溫度24～35℃，濕度超過10%時，由黃曲霉、寄生曲霉等在生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在熱帶和亞熱帶地區(qū)水產(chǎn)飼料中普遍檢出，帶來了巨大的經(jīng)濟損失。飼料和原料中黃曲霉毒素B1（AFB1）污染使畜禽攝食率降低、代謝紊亂、飼料轉(zhuǎn)化效率降低、生產(chǎn)能力下降及肝臟腎臟損傷，造成免疫力下降，提高了機體對疾病的易感性，嚴(yán)重時甚至造成死亡，其次通過食物的直接消費或進(jìn)食含有AFB1的畜禽產(chǎn)品的間接消費對人類生命健康安全帶來威脅。

目前關(guān)于AFB1的研究多集中在畜禽動物上，對于水產(chǎn)動物影響的研究也多集中在魚類。有關(guān)飼料中AFB1對凡納濱對蝦的影響機理研究并不多見，尤其是從分子和基因?qū)用娴难芯俊１狙芯繑M在已有AFB1對水產(chǎn)動物影響研究的基礎(chǔ)上，測定AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，從生理和分子層面去探索AFB1導(dǎo)致凡納濱對蝦肝胰腺病變發(fā)生的過程及機制，為預(yù)防和消除該類毒素對水產(chǎn)動物的影響提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凡納濱對蝦由青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司提供，隨機挑選健康無病，規(guī)格均一的凡納濱對蝦[初始體重(2.40±0.13)g]，正式試驗開始前將凡納濱對蝦暫養(yǎng)在水族箱中，以對照組飼料飽食投喂，暫養(yǎng)1周后開始試驗。

1.2 試驗飼料的制備

由于AFB1毒素對水產(chǎn)動物影響的研究多集中在長期低劑量暴露條件下，因此本研究目的是以高濃度的AFB1短時間內(nèi)對凡納濱對蝦肝胰腺產(chǎn)生的影響。Ostrowaki-Meissner等研究結(jié)果顯示以15 mg/kg AFB1飼喂凡納濱對蝦2周，造成100%死亡率。因此本試驗選取15 mg/kg作為試驗濃度，12 d作為試驗周期。

在基礎(chǔ)配合飼料中添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，美國）配制成毒素含量分別為0 mg/kg的對照組和15 mg/kg的試驗組飼料。試驗組飼料的制備采用以下方法，將AFB1溶解于氯仿后加入魚油混合均勻，于37℃水浴2 h時，將氯仿蒸發(fā)備用。試驗組溶解AFB1所需魚油等量添加于對照組飼料中。兩組飼料均置于4℃冰箱保存?；A(chǔ)飼料為煙臺大樂飼料有限公司生產(chǎn)的南美白對蝦飼料1#料，飼料基礎(chǔ)營養(yǎng)組成為粗蛋白42.3%、粗脂肪7.2%、灰分15.5%、水分11.6%。

1.3 飼養(yǎng)管理

對蝦在室內(nèi)規(guī)格為80 cm×60 cm×50 cm的試驗水箱中飼養(yǎng)12 d，試驗用水為砂濾后的天然海水，鹽度30。每種飼料設(shè)置3個平行組，每組放養(yǎng)對蝦50尾。按照對蝦體質(zhì)量的7%投喂飼料。每天分別在8∶00、14∶00、19∶00各投喂1次。每天上午喂料前用虹吸法清除糞便并換水1/3，及時巡查，揀出死蝦。每天記錄水溫、溶解氧和pH值。試驗期間水溫(28±1)℃，溶氧量≥6 mg/l，pH值8.0±0.2。

1.4 基因表達(dá)的測定

分別在第1、4、8 d和12 d取對照組和試驗組的凡納濱對蝦樣品，每個平行取3只蝦，將肝胰腺完整分離后，取米粒大小的組織保存于多管RNA組織樣本保存液中，4℃冰箱過夜，然后將樣品冷凍于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取：按照RNA提取試劑盒（TaKaRa）的說明書進(jìn)行。

RNA反轉(zhuǎn)：利用TransScript?One-Step gDNA Re?moval and cDNA Synthesis Kit試劑盒（全式金生物科技有限公司），按其說明書進(jìn)行?；虮磉_(dá)測定所用引物如表1所示。

實時定量PCR（qPCR）：參照說明書，利用TransStar Top Green qPCR PCR Super mix試劑盒(全式金生物科技有限公司)進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)的測定。用2-ΔΔCT的方法對差異表達(dá)基因進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5 抗氧化酶活性測定

表1 試驗所用引物及序列

分別在第1、4、8 d和12 d時取對蝦肝胰腺，每個平行取4只混樣，-80℃冰箱保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的測定。酶活性測定按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的單因素變量方差分析方法（One-Way ANO?VA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1對凡納濱對蝦存活率的影響

飼料中AFB1對凡納濱對蝦存活率的影響見表2。從表2中可以看出，試驗期間，試驗組對蝦的存活率均顯著低于對照組（P＜0.05），第12 d試驗結(jié)束時對照組對蝦的存活率為(97.33±0.02)%，顯著高于試驗組的(65.50±0.03)%（P＜0.05）。

表2 AFB1對凡納濱對蝦累積存活率的影響(%)

2.2 AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化物酶活性的影響

2.2.1 超氧化物歧化酶（見圖1）

由圖1可知，試驗期間，試驗組凡納濱對蝦肝胰腺SOD活性均顯著高于對照組（P＜0.05），在第12 d時達(dá)到最大值21.50 U/mg。

2.2.2 過氧化物酶（見圖2）

由圖2可知，試驗期間，試驗組凡納濱對蝦肝胰腺CAT活性均顯著高于對照組（P＜0.05），整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第4 d時達(dá)到最大值5.99 U/mg。

圖1 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性的影響

圖2 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺過氧化物酶活性的影響

2.2.3 谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（見圖3）

圖3 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性的影響

由圖3可知，試驗期間，試驗組凡納濱對蝦肝胰腺GST活性均顯著高于對照組（P＜0.05），總體呈現(xiàn)上升趨勢，在第12 d時達(dá)到最大值16.41 U/mg。

2.2.4 谷胱甘肽過氧化物酶（見圖4）

由圖4可知，試驗期間，試驗組凡納濱對蝦肝胰腺GSH-Px活性均顯著高于對照組（P＜0.05），總體呈現(xiàn)下降趨勢，在第1 d時為最大值24.18 U/mg。

圖4 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

2.3 AFB1對凡納濱對蝦mTOR信號通路和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 凡納濱對蝦肝胰腺中mTOR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)（見圖5）

圖5 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺中mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5可知，與對照組相比，試驗組對蝦肝胰腺中4EBP基因在第1、4、8 d和12 d時表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中在第8 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的35.27倍；P70s6k呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，其中P70s6k基因在第4 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的3.33倍，在第8 d和12 d時顯著下調(diào)（P＜0.05）；eIF4E1A基因在第1 d和4 d時表達(dá)水平與對照組相比沒有顯著性差異，在第12 d時顯著下調(diào)，僅為對照組的0.32倍；eIF4E2基因在第1 d和4 d時顯著上調(diào)（P＜0.05），在第1 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的1.87倍，在第12 d時顯著下調(diào)，僅為對照組的0.34倍。

圖6 飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.2 凡納濱對蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因的表達(dá)（見圖6）

由圖6可知，與對照組相比，GST基因在試驗組對蝦肝胰腺中表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第8 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的9.55倍；ProPO基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第8 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的60.51倍；Rab基因表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第4 d時上調(diào)幅度最大，為對照組的6.37倍，在12 d時顯著下調(diào)，僅為對照組的0.55倍。

3 討論

肝臟是黃曲霉毒素B1的靶器官，而肝胰腺又是對蝦最主要的消化和免疫器官，對蝦肝胰臟的健康程度是養(yǎng)蝦成敗的關(guān)鍵因素之一。目前，關(guān)于AFB1對對蝦肝胰腺氧化損傷的研究大都停留在宏觀水平，針對AFB1對其氧化損傷及分子機理的研究較為缺乏。因此，研究飼料中AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺損傷作用有著重要的意義。

3.1 AFB1對抗氧化酶活性的影響

呼吸爆發(fā)是甲殼動物對抗外來物入侵的一種重要防御策略，它發(fā)生迅速而且短暫，能夠產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。當(dāng)AFB1侵入凡納濱對蝦體內(nèi)時，會激發(fā)對蝦天然免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的ROS以對抗AFB1的侵入，雖然釋放ROS是甲殼動物對抗外來物侵入的重要防御機制，但是產(chǎn)生過量會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，而大多數(shù)細(xì)胞具有酶促體系，包括SOD、CAT、GST、GSH-Px等都是必不可少的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，能夠清除ROS和維護細(xì)胞氧化還原平衡，阻止或修復(fù)氧化損傷。肝胰腺被認(rèn)為是甲殼動物最主要的免疫器官，是產(chǎn)生清除外來物的免疫防御分子的主要場所，也是ROS產(chǎn)生和釋放的中心。Han等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼喂含AFB1超過 10 μg/kg時，異育銀鯽血清中的SOD顯著高于對照組。Zeng等研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料中AFB1含量為1 000 μg/kg時，飼喂凡納濱對蝦8周，GST活性顯著高于對照組和低濃度組。Manal等研究結(jié)果顯示，注射了AFB1的羅非魚，肝胰臟中GSH-Px的活性顯著高于對照組，而CAT的活性降低。與上述研究結(jié)果相似，本試驗結(jié)果顯示，在短期飼喂15 mg/kg AFB1后，凡納濱對蝦肝胰腺中SOD、GST、GSH-Px、CAT活性均顯著高于對照組，且GST基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明凡納濱對蝦在攝食含AFB1的飼料后，肝胰腺的抗氧化酶系統(tǒng)被激活，由此來清除過量的ROS和維持細(xì)胞氧化還原平衡。有研究發(fā)現(xiàn)AFB1會引起機體抗氧化酶活性的降低，可能是因為AFB1對機體造成損害，使機體生成抗氧化酶的能力下降。本研究中沒有出現(xiàn)抗氧化酶活性的降低可能是由于試驗時間短，AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺的損傷還未達(dá)到抑制肝胰腺產(chǎn)生抗氧化酶的程度。

3.2 AFB1對mTOR信號通路的影響

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子受外界壓力影響，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡系統(tǒng)或加強防御系統(tǒng)來調(diào)控細(xì)胞存活或死亡。其中mTOR信號通路在細(xì)胞生長過程中處于核心地位，不僅具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成等多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞的生長、增殖、凋亡中也起到了重要作用。已有研究顯示mTOR信號通路與人類疾病相關(guān)，mTOR信號通路異常可誘發(fā)癌癥和糖尿病。而AFB1是一種可誘發(fā)肝癌性毒素，因此mTOR信號通路可作為AFB1對肝臟產(chǎn)生損傷的標(biāo)志性通路。徐昌志研究結(jié)果顯示，注射25 μg/ml微囊藻毒素，大鼠肝組織中mTOR和s6k磷酸化水平出現(xiàn)下降趨勢，表明毒素可引起mTOR信號通路異常，誘發(fā)原發(fā)性肝癌。Xu等研究顯示帕金森病毒素在開始階段，PC12細(xì)胞中s6k表達(dá)水平上調(diào)，而隨后mTOR通路受到抑制，阻礙s6k和4EBP的磷酸化，細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，4EBP基因在試驗期間的表達(dá)水平均顯著高于對照組，而P70s6k、eIF4E1A和eIF4E2基因的表達(dá)水平隨攻毒時間的增加先上升后下降，表明毒素侵入機體后mTOR信號通路調(diào)控出現(xiàn)異常。有研究表明機體在低能和氧化壓力下，mTOR信號通路調(diào)控會受到抑制，因此抑制了細(xì)胞的生長和生物合成過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在本研究中，mTOR信號通路異?？赡苁怯捎贏FB1誘發(fā)機體產(chǎn)生過量ROS以對抗其侵入，抗氧化酶活性的升高也證明了ROS的產(chǎn)生，而正是這種氧化壓力抑制了mTOR信號通路，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.3 AFB1對免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

Rab蛋白在細(xì)胞生物合成以及胞吞胞吐等囊泡轉(zhuǎn)運的各個環(huán)節(jié)中起著重要的調(diào)控作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)Rab在細(xì)胞吞噬體的形成和成熟中有重要影響，在機體先天免疫中，對清除外來病原菌也起到了重要作用。有研究顯示，感染白斑病病毒的凡納濱對蝦48 h，在肝胰腺中Rab基因的表達(dá)水平顯著高于空白組。而本研究結(jié)果顯示飼喂AFB1的凡納濱對蝦肝胰腺中Rab基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與Wang等研究結(jié)果一致，其研究顯示在各種環(huán)境（溫度、鹽度、細(xì)菌、重金屬和pH值）脅迫下，凡納濱對蝦肝胰腺中Rab基因的表達(dá)水平與對照組相比均有顯著變化，隨脅迫時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。表明Rab參與了凡納濱對蝦清除AFB1的免疫反應(yīng)，吞噬作用在抵御AFB1對蝦體的毒害過程中發(fā)揮了重要作用。酚氧化酶原系統(tǒng)是甲殼動物最重要的免疫反應(yīng)體系，其PO活力的強弱與機體的免疫力直接相關(guān)，可作為衡量甲殼動物免疫功能大小的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，試驗組中ProPO的表達(dá)量在試驗前期顯著高于對照組，在第8 d時達(dá)到最大值，而在第12 d時下調(diào)，與王丹麗等研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)注射了白斑病病毒的凡納濱對蝦肝胰腺中ProPO表達(dá)水平在24 h時顯著高于空白組，隨著感染時間延長ProPO基因表達(dá)水平呈顯著下降趨勢，這表明Pro?PO基因在對蝦抗毒素的非特異性免疫過程中發(fā)揮了作用，可以作為毒素侵染前期的參考指標(biāo)。

4 結(jié)論

與現(xiàn)有研究的長期攻毒試驗不同，本研究首次以AFB1對凡納濱對蝦進(jìn)行短期投喂攻毒試驗，探討了AFB1對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化酶活性的影響，并首次探究了AFB1對凡納濱對蝦mTOR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。本研究結(jié)果表明飼料中黃曲霉毒素（15 mg/kg）對于凡納濱對蝦有顯著影響，飼喂12 d就損害其肝胰腺，造成抗氧化酶活性升高，mTOR信號通路受到抑制，死亡率達(dá)到了34.5%，在實際生產(chǎn)過程中可能因此造成疾病和大范圍死亡。本研究以期能為水產(chǎn)品飼料中AFB1的預(yù)防和消除提供科學(xué)有效的依據(jù)。

（參考文獻(xiàn)刊略，需者可函索848334766@qq.com）