高占義 魏月娟 王彥敏 李二娟 張 姍 王慶海

(1 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院心內(nèi)科，滄州，061000； 2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院超聲科，滄州，061000； 3 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院科教科，滄州，061000)

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自擬強(qiáng)心湯對心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的實驗研究

高占義1魏月娟1王彥敏2李二娟1張 姍1王慶海3

(1 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院心內(nèi)科，滄州，061000； 2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院超聲科，滄州，061000； 3 河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院科教科，滄州，061000)

目的：探討自擬強(qiáng)心湯對心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的作用機(jī)制。方法：采用結(jié)扎左冠狀動脈法制備大鼠心梗后慢性心力衰竭動物模型；8周后，給予藥物灌胃治療；經(jīng)治療4周后，采用通過頸動脈插管測定大鼠血流動力學(xué)狀態(tài)，通過實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法和Western Bolt法檢測心肌鈣調(diào)控蛋白肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)、雷尼丁受體2(RYR2)mRNA水平及其蛋白表達(dá)量。結(jié)果：模型組大鼠的心功能顯著下降，主要表現(xiàn)在血流動力學(xué)參數(shù)改變，其中左室舒張末期壓(LVEDP)明顯升高(P<0.01)，左室收縮壓(LVSP)、左室上升最大速率(+LVdp/dtmax)及左室下降最大速率(-LVdp/dtmax)絕對值均降低(P<0.05)；心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA水平及其蛋白表達(dá)量均明顯下降(P<0.05)。給予自擬強(qiáng)心湯干預(yù)后，能夠有效的降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；能夠升高心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA及其蛋白表達(dá)量的水平(P<0.05)。結(jié)論：自擬強(qiáng)心湯能夠有效的改善心力衰竭大鼠的心功能，其機(jī)制可能與升高心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白表達(dá)量，改善鈣循環(huán)有關(guān)。

自擬強(qiáng)心湯；慢性心力衰竭；心肌舒縮功能；血流動力學(xué)

自擬強(qiáng)心湯是由附子、白術(shù)、茯苓等溫陽、利水中藥組成的復(fù)方制劑，臨證治療心腎陽虛型心力衰竭病。RyR2是肌漿網(wǎng)上的鈣離子釋放通道，負(fù)責(zé)使Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)中釋放出來，促進(jìn)Ca2+與肌鈣蛋白C結(jié)合，使肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合，形成橫橋，啟動心肌收縮[1]；SERCA2a為肌漿網(wǎng)鈣泵，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)內(nèi)大部分Ca2+回攝入肌漿網(wǎng)內(nèi)并儲存，使Ca2+濃度迅速下降，并與肌鈣蛋白C解離，橫橋解除，使心肌細(xì)胞舒張[2]。二者分別負(fù)責(zé)Ca2+的釋放和攝取，進(jìn)而保證正常的鈣循環(huán)，而鈣循環(huán)的紊亂可導(dǎo)致心肌舒縮功能的障礙。本實驗旨在研究自擬強(qiáng)心湯對心力衰竭大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RyR2含量的影響，進(jìn)而探討自擬強(qiáng)心湯改善心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的作用機(jī)制及干預(yù)環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動物 正常雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，清潔級。

1.2 藥物與試劑 自擬強(qiáng)心湯由附子、白術(shù)、茯苓等11味中藥組成，均由滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，并于此院中藥房完成制劑；纈沙坦膠囊(代文)由施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)；PCR試劑盒；cDNA合成試劑盒；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒；

1.3 儀器 PowerLab/4SP生物信號處理分析系統(tǒng)(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；MLT1050/D型高精度壓力換能器(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；Chart v 5.0記錄和分析軟件(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；ALC-V8S小動物呼吸機(jī)(奧爾科特科技生物有限公司生產(chǎn))。

1.4 分組與給藥 將清潔級SD大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照完全隨機(jī)分為假手術(shù)組10只，模型組、纈沙坦組、自擬強(qiáng)心湯組各18只。對除假手術(shù)組外的其他各組行左冠脈結(jié)扎術(shù)，10只假手術(shù)組動物除穿線不結(jié)扎外，其余操作同模型組。術(shù)后8周開始灌胃給藥，根據(jù)“實驗動物與人按體表面積等效量換算比率”折算[3]，模型組和對照組予同體積的蒸餾水灌胃；纈沙坦組予代文懸濁液灌胃，給藥劑量為8 mg/kg；自擬強(qiáng)心湯組予自擬強(qiáng)心湯水溶液灌胃，給藥劑量為0.9 g/kg。連續(xù)給藥4周，給藥1次/d。

1.5 大鼠模型制作 根據(jù)徐淑云[3]的《藥理實驗方法學(xué)》采用冠狀動脈結(jié)扎法(LAD)制備大鼠慢性心力衰竭模型，將雄性SD大鼠喂養(yǎng)一周，術(shù)前禁食12 h，用3%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，按照每公斤35 mg注射，麻醉好后將大鼠于手術(shù)臺上固定，于手術(shù)部位備皮，經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機(jī)保證呼吸功能，在大鼠四肢皮下連接心電監(jiān)護(hù)。沿左側(cè)胸前第3、4肋間部位將皮膚切開并逐層分離，打開胸腔，沿肋間切開，向上推開胸腺，扯開胸膜及心包膜，找到左心耳，在左心耳下方2～3 mm處用5.0號絲線穿過左冠狀動脈前降支進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎后左室壁的顏色由紅變白，同時會出現(xiàn)心室壁運(yùn)動減弱等表現(xiàn)。同時，心電監(jiān)護(hù)顯示II導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后出現(xiàn)的ST段亦明顯抬高，證實結(jié)扎手術(shù)成功。待穩(wěn)定后，關(guān)閉胸腔并逐層縫合。對照組大鼠穿線后不行結(jié)扎術(shù)，術(shù)后均用青霉素(40萬U/只)連續(xù)抗感染治療2 d[4]。

1.6 血流動力學(xué)的測定[5]在灌胃給藥4周后，采用生物信號處理分析系統(tǒng)測定大鼠血流動力學(xué)，術(shù)前予禁食不禁水，稱重后先用肝素鈉抗凝30 min，按照每公斤體重1200 μ/kg注射，之后用戊巴比妥鈉行腹腔麻醉。將麻醉好的大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，從右側(cè)頸部分離右側(cè)頸總動脈，固定切口，用一根線結(jié)扎動脈遠(yuǎn)心端，在另一端插入心導(dǎo)管，通過生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄血流動力學(xué)參數(shù)；首先，將心導(dǎo)管在頸總動脈中觀測心率，待心率穩(wěn)定后，將心導(dǎo)管推入左心室，待穩(wěn)定后，記錄大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力上升和下降變化最大速度的參數(shù)值(±LVdp/dtmax)。

1.7 心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA表達(dá)及其蛋白相對表達(dá)量的測定 提取心肌組織，采用實時熒光定量FQ-PCR法檢測SERCA2a、RYR2 mRNA水平，采用Western blotting法測定鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白相對表達(dá)量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學(xué)測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠LVEDP水平明顯升高，LVSP水平明顯降低(P<0.01)，+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax絕對值亦均降低(P<0.05)；提示心力衰竭時，大鼠心肌舒張和收縮功能減退。經(jīng)治療后，各用藥組與模型組相比，纈沙坦組能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；自擬強(qiáng)心湯組能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax水平(P<0.01)，亦能升高大鼠-LVdp/dtmax水平(P<0.05)。各組間心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、2。

2.2 各組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的測定 采用FQ-PCR法檢測心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的相對表達(dá)量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的表達(dá)量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭時心肌舒縮功能下降。經(jīng)治療后，與模型組比較，僅有自擬強(qiáng)心湯組心肌鈣調(diào)蛋白SERCA2a和RYR2 mRNA水平均升高(P<0.05)；而纈沙坦組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠心率及左室內(nèi)壓測定結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表2 各組大鼠+LVdp/dtmax測定結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表3 各組大鼠SERCA2a、RYR2 mRNA的測定結(jié)果

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表4 各組大鼠SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)量的測定結(jié)果

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

2.3 各組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)量的測定 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭時心肌舒縮功能下降。經(jīng)治療后，與模型組比較，僅有自擬強(qiáng)心湯組心肌鈣調(diào)蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達(dá)量水平升高(P<0.05)；而纈沙坦組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

3 討論

心力衰竭是最常見的心血管疾病之一，心功能的異常體現(xiàn)在舒張與收縮功能2個方面，在導(dǎo)致心肌舒縮功能異常的眾多因素中，心肌興奮收縮耦聯(lián)障礙占有重要地位，其中，鈣循環(huán)的異常是導(dǎo)致興奮收縮耦聯(lián)障礙發(fā)生的重要原因之一[6]。研究顯示，心肌細(xì)胞的舒張功能與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+清除相關(guān)，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+消除主要是經(jīng)SERCA2a再攝取[7]，心肌細(xì)胞收縮性的強(qiáng)弱是由胞質(zhì)內(nèi)LTCC、RyR2的狀態(tài)以及肌漿網(wǎng)鈣含量等因素決定[8]。總之，肌漿網(wǎng)中鈣離子循環(huán)是心肌收縮和舒張的重要環(huán)節(jié)，而鈣循環(huán)包括鈣回攝、鈣釋放及鈣儲存3個過程，任一過程的異常都將導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞，這種破壞是心力衰竭心肌細(xì)胞舒縮功能下降的主要原因[9]。

目前強(qiáng)心藥物的主要作用機(jī)制是通過增加Ca2+的濃度來增加心肌收縮力。而研究表明長期使用會產(chǎn)生鈣超載現(xiàn)象，早期心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，使心肌收縮力的加強(qiáng)，但是Ca2+的持續(xù)增高使Ca2+與肌鈣蛋白解離過程發(fā)生障礙，造成心肌舒張功能的異常[10]。再者，Ca2+急驟增多能夠誘發(fā)持久而嚴(yán)重的肌絲攣縮，形成收縮帶甚至發(fā)生肌絲斷裂；在其過程中會消耗大量等能量物質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)肌絲橫橋擺動無力，進(jìn)而阻礙心肌收縮[11]。此外，鈣循環(huán)的異還可激活由Ca2+為上游的信號分子，如蛋白激酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等，而這些信號分子能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥厚和細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)，此為發(fā)生心力衰竭的最基本機(jī)制[12]。新型的強(qiáng)心藥即鈣離子敏感藥(如左西孟旦)，是通過增加肌鈣蛋白對Ca2+的敏感性而增加心肌收縮力。其過程不增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，所以不會引起Ca2+超載所致的心律失常的問題，也不需要增強(qiáng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)時的能量消耗，不良反應(yīng)較少[13]。目前，許多臨床試驗已證實了左西孟旦的安全性和有效性，短期使用可以明顯改善心力衰竭癥狀，但是對長期生存率的影響還有待進(jìn)一步研究，而且亦沒有提示改善心室重構(gòu)的問題。因此，本實驗從中醫(yī)藥角度探討中醫(yī)中藥改善鈣循環(huán)，進(jìn)而改善心肌舒縮功能的作用機(jī)制。

本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋SERCA2a的相對表達(dá)量下降，提示心力衰竭時大鼠鈣回攝能力減弱，影響了胞質(zhì)內(nèi)的鈣清除，使舒張功能受損；RyR2 mRNA及其蛋白表達(dá)亦下降，影響了鈣釋放，導(dǎo)致鈣儲存量減少，影響了心肌細(xì)胞的收縮，2者共同導(dǎo)致心肌興奮收縮耦聯(lián)過程障礙，導(dǎo)致心肌舒縮功能的下降。研究中血流動力學(xué)參數(shù)也發(fā)生改變，心力衰竭大鼠LVEDP水平上升、-dp/dt max水平的下降，可反映心肌舒張功能的減退；LVSP、+LVdp/dtmax的下降可反映心肌收縮功能的障礙；與前者相符。從中醫(yī)角度說明，在心力衰竭時，因心氣推動無力，導(dǎo)致心輸出量、心肌收縮力和心室順應(yīng)性明顯下降，進(jìn)而舒縮功能減退。經(jīng)治療后，采用溫補(bǔ)心腎法可以增加SERCA2a、RyR2 mRNA及其蛋白表達(dá)量，增加鈣回攝、鈣釋放能力，提高心肌細(xì)胞的收縮和舒張速率，改善鈣循環(huán)，進(jìn)而改善心肌舒縮功能。血流動力學(xué)測定結(jié)果亦顯示，采用溫補(bǔ)心腎法亦能降低LVEDP水平，升高-LVdp/dtmax、LVSP、+LVdp/dtmax水平，進(jìn)而改善心肌舒縮功能。

近年來，在治療CHF的治法中，90%左右采用益氣溫陽、活血利水之法，臨床效果顯著[14-15]。自擬強(qiáng)心湯是通過采用溫補(bǔ)心腎，溫陽利水的方法改善心肌SERCA2a、RyR2的表達(dá)，進(jìn)而改善鈣循環(huán)。其治療方式不是單純以增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為目的，而是通過改善心肌細(xì)胞的舒張和收縮速率，進(jìn)而改善心功能，為臨床治療提供新的思路。

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(2016-01-14收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Study on myocardial systolic and diastolic function of Qiangxin Tang on heart failure after myocardial infarction in rats

Gao Zhanyi1，Wei Yuejuan1,Wang Yanmin2,Li Erjuan1,Zhang Shan1,Wang Qinghai3

(1DepartmentofCardiology,CangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineClinicalCollege,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 2Departmentofultrasound,CangzhouintegratedtraditionalChinesemedicineandWesternmedicine,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 3HebeiMedicalUniversityaffiliatedCangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineCollegeofscienceandeducation,Cangzhou061000,China)

Objective:To clarify myocardial systolic and diastolic function and possible mechanism of Qiangxin Tang on the model of heart failure.Methods:Model of heart failure after myocardial infarction was prepared by left coronary artery ligation.After 8 weeks，take a lavage treatment every day；After 4 weeks of continuous administration，cardiac hemodynamics parameters were recorded and SERCA2a，RYR2 mRNA level were detected by PCR(FQ-PCR)and SERCA2a，RYR2 protein expression were detected by Western bolt.Results:compared with control group，cardiac function of model group is lower：hemodynamic parameters LVEDP is increased obviously(P<0.01),LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax absolute values were all lower(P<0.05)，and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of model group rats was decreased(P<0.05).Compared with model group，Qiangxin Tang group could reduce LVEDP levels(P<0.05),increase LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax levels(P<0.01),and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of Qiangxin Tang were higher.Conclusion:Qiangxin Tang can effectively improves cardiac function in heart failure rats; Its mechanism is related with improving calmodulin SERCA2a、RYR2 and improving calcium cycle.

Qiangxin Tang；Chronic Heart Failure；Myocardial systolic and diastolic function；hemodynamic

河北省中醫(yī)藥管理局“自擬強(qiáng)心湯調(diào)控CaN-NFAT信號通路干預(yù)慢性心力衰竭的臨床研究”(編號：2015287)

高占義(1977.06—)，男，學(xué)士，主治醫(yī)師，研究方向：主要從事心血管疾病的臨床、科研、教學(xué)及介入治療工作，Tel：(0317)2179083，E-mail:gaozhanyi1977@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.042