張彤宇，李俞辰，戴家興，吳培，王永朋，史懷璋

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種常見且危及生命的腦血管疾病，發(fā)病率占全部卒中的5%，死亡率超過50%[1]。目前，臨床尚無完全有效的治療方案可確保SAH臨床預(yù)后良好。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為遲發(fā)性腦血管痙攣（delayed cerebral vasospasm，CVS）是導(dǎo)致SAH后預(yù)后不良的主要原因，然而，新近研究表明，早期腦損害（early brain injury，EBI）才是導(dǎo)致SAH患者死亡率居高不下的關(guān)鍵因素[1]，但EBI的產(chǎn)生機(jī)制尚未明確。鈣超載（calcium overloaded）在線粒體內(nèi)可引起氧化磷酸化過程障礙，線粒體膜電位降低，三磷腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）分解加速，氧化應(yīng)激水平提升，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆性損傷[2]。在SAH過程中產(chǎn)生的顱內(nèi)壓增高、腦血管痙攣、血腦屏障破壞等EBI癥狀均是引起線粒體鈣超載的重要因素[1]。因此，研究線粒體鈣超載的機(jī)制對于減輕EBI后神經(jīng)系統(tǒng)損害便顯得尤為重要。線粒體和與之偶聯(lián)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中兩個(gè)主要的Ca2+儲存場所，其膜上不同受體和配體的結(jié)合調(diào)控著細(xì)胞Ca2+的攝取與釋放，從而維持著細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的穩(wěn)態(tài)。隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，各細(xì)胞器膜的分子層面結(jié)構(gòu)已日漸清晰，其膜上各受體與配體結(jié)合產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也在不斷被探知[3]。本文就有關(guān)線粒體及其偶聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不同膜受體在SAH后形成線粒體鈣超載過程中有關(guān)作用機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

1 線粒體內(nèi)膜受體對Ca2+的攝取

相比能夠透過離子和小分子的線粒體外膜，線粒體內(nèi)膜有著高度選擇透過性，離子在通過線粒體基質(zhì)與胞質(zhì)時(shí)需要特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體。Ca2+跨濃度梯度在胞質(zhì)與線粒體基質(zhì)間轉(zhuǎn)運(yùn)的媒介被稱為線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）。MCU廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞中。研究證實(shí)，MCU是Ca2+單向傳遞的通道結(jié)構(gòu)，具有Ca2+電傳導(dǎo)通道活性，而此通道可被釕紅（ruthenium red，RR）抑制，可被精胺激活[4]。García-Rivas Gde等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MCU特異性抑制劑——釕360（ruthenium360，Ru360）能夠通過抑制鈣超載，改善心肌缺血后功能的損傷。Yan等[6]首先發(fā)現(xiàn)，由于SAH后鐵貯存產(chǎn)生的EBI中存在著MCU的作用，SAH模型鼠的顳葉皮質(zhì)中線粒體鈣離子濃度顯著提升。另有研究顯示，應(yīng)用RR抑制MCU，從而阻斷Ca2+的貯存可以減少氧化應(yīng)激，增加能量供給，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞色素C、半胱天冬蛋白酶3（caspase 3）的作用，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡，保持神經(jīng)元的完整性，改善SAH早期的相關(guān)損傷[7]。

除了MCU，線粒體Ca2+調(diào)節(jié)同時(shí)還受到線粒體Ca2+攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake1，MICU1）和線粒體Ca2+攝入蛋白2（mitochondrial calcium uptake2，MICU2）的雙重調(diào)控。Perocchi等[8]利用比較生理學(xué)、進(jìn)化基因組學(xué)和線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法尋找線粒體鈣攝入相關(guān)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)了MICU1。MICU1具有兩個(gè)典型的EF手形結(jié)構(gòu)域（EF hand domain），該結(jié)構(gòu)可感知Ca2+濃度的變化。在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度處于低水平時(shí)，EF手型結(jié)構(gòu)域提供了一個(gè)對Ca2+高親和力的敏感集團(tuán)，相當(dāng)于為細(xì)胞提供了一個(gè)“門控”功能以調(diào)節(jié)MCU的活動，從而防止線粒體鈣超載[9]。Mallilankaraman等[10]則發(fā)現(xiàn)，MICU1表達(dá)下降可導(dǎo)致靜息狀態(tài)下單向轉(zhuǎn)運(yùn)體活動增加，從而引起線粒體鈣超載；而MICU1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于低水平（＜3 μmol/L）時(shí)發(fā)揮著限制MCU相關(guān)Ca2+攝取的機(jī)制，而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于高水平時(shí)反而不發(fā)揮此作用。目前研究表明，SAH等疾病后的腦部功能性障礙可能與MICU1變異導(dǎo)致的鈣信號變化有關(guān)[11]。目前在SAH中MICU1作用仍未明確，有待進(jìn)一步研究。

另一個(gè)MCU調(diào)控因子是MICU2，其與MICU1一樣通過EF手型結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)Ca2+濃度。MICU2一直被認(rèn)為與MICU1一同作用于MCU，使得Ca2+濃度呈S形分布。然而，Patron等[12]研究發(fā)現(xiàn)MICU1在低濃度Ca2+條件下對MCU的“門控”作用是依靠MICU2完成的，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于低濃度時(shí)，MICU2起主導(dǎo)作用，抑制MCU的活動，減少細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+向線粒體內(nèi)流，抑制MICU2后MICU1可顯著促進(jìn)線粒體Ca2+濃度的提升；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+呈高濃度時(shí)，MICU1則促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體鈣信號的生成，使Ca2+向線粒體鈣庫內(nèi)流，以保證胞內(nèi)Ca2+的平衡，誘發(fā)線粒體鈣超載。因此，這一相互作用將有望應(yīng)用于臨床，在SAH中通過降低相應(yīng)MICU的表達(dá)來調(diào)控Ca2+濃度，從而抑制線粒體鈣超載造成的EBI。

2013年，Sancak等[13]發(fā)現(xiàn)了MCU重要調(diào)節(jié)因子（essential MCU regulator，EMRE），EMRE是一個(gè)10 kD大小，擁有獨(dú)立跨膜結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞動物特有蛋白；敲除EMRE后，盡管MCU仍可以被激活并寡聚化，但Ca2+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能無法完全發(fā)揮甚至喪失，證實(shí)EMRE在MCU介導(dǎo)的鈣超載過程中起到關(guān)鍵溝通作用；同時(shí)，EMRE的表達(dá)也需要MCU及MICU1的相互作用，是MICU1和MICU2以及MCU傳導(dǎo)Ca2+的中間環(huán)節(jié)。不同于這3種鈣通道相關(guān)蛋白的是，植物及原核生物中不存在EMRE，因此，EMRE在哺乳動物Ca2+調(diào)節(jié)中的特異性越來越得到重視[12]。在SAH導(dǎo)致的鈣超載過程中，MICU1作為門控通道聯(lián)合MICU2及EMRE共同調(diào)節(jié)此過程的發(fā)生發(fā)展[14]。這也使這幾種受體成為SAH鈣超載研究的熱點(diǎn)之一。

2 線粒體外膜受體對Ca2+的攝取

線粒體基質(zhì)內(nèi)儲存和蓄積Ca2+需要跨越內(nèi)外兩層膜，而線粒體外膜是其攝取的第一道屏障。線粒體外膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一種具有電壓依賴性、環(huán)孢素敏感性以及高傳導(dǎo)性的膜通道。相關(guān)研究認(rèn)為，mPTP主要由腺苷酸轉(zhuǎn)位子（adenine nucleotide translocator，ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channels，VDACs）和親環(huán)素結(jié)合蛋白D（cyclophilin-D，CyP-D）組成[15]。如果線粒體基質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)或外界溶液之間存在濃度梯度，Ca2+可以通過mPTP而釋放。因此，mPTP被認(rèn)為是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要結(jié)構(gòu)。

mPTP組成成分VDACs是一類小分子親水集團(tuán)，是ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、細(xì)胞色素C、丙酮酸鹽、蘋果酸鹽以及其他代謝產(chǎn)物的主要擴(kuò)散孔道。盡管VDACs在調(diào)節(jié)線粒體鈣活動中的具體作用仍有爭議，但在線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，VDACs與IP3R3偶聯(lián)并經(jīng)由GRP75介導(dǎo)，可控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號進(jìn)入線粒體的過程已經(jīng)被證實(shí)[16]。Li等[17]在研究線粒體自噬的腦保護(hù)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)SAH早期即有VDACs表達(dá)升高，分別在出血后24 h及48 h表達(dá)顯著升高，而兩者無顯著差異，從而證實(shí)了VDACs可能與SAH引起的EBI有關(guān)。同時(shí)，Martin等[18]研究顯示，VDACs在神經(jīng)元中能夠介導(dǎo)mPTP攝取Ca2+，并誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，VDACs在SAH中很可能是引起鈣超載的重要因素。

目前，有關(guān)mPTP另外兩種組成成分ANT和CyP-D在SAH鈣超載中作用的相關(guān)研究少見。但在腦損傷過程中，二者均有參與：ANT1是ANT的其中一種異構(gòu)體形式，其可通過上調(diào)轉(zhuǎn)移生長因子β1（transforming growth factor，TGF-β1），誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后形成膠質(zhì)瘢痕[19]；而CyP-D在腦缺血時(shí)參與了由于細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡過程[20]。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜偶聯(lián)組分對Ca2+的攝取

線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）膜緊密接觸。Vance等[21]分離得到ER與線粒體相互偶聯(lián)的膜組分，并命名為線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria associated ER membrane，MAM）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，MAM在某些磷脂代謝中也具有重要作用[22-23]。Rizzuto等[24-25]通過顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間物理偶聯(lián)的部位可形成高濃度的Ca2+微區(qū)，證實(shí)了MAM可以影響細(xì)胞Ca2+信號調(diào)控。MAM與鈣信號相關(guān)的受體很多，有三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-triphate receptors，IP3Rs）和蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RYRs）等[26]。

IP3Rs受3個(gè)基因編碼，每個(gè)基因均有各自不同程度的IP3親和力。研究顯示，通過敲除IP3R1和IP3R3基因可以誘導(dǎo)Ca2+攝取降低[27]。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，IP3Rs可介導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。Kasseckert等[29]在研究SAH后星型膠質(zhì)細(xì)胞能量危機(jī)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過抑制IP3Rs可以限制胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的升高，從而降低細(xì)胞壞死率；證實(shí)了血性腦脊液可以使IP3Rs受體激活，mPTP開放，瞬時(shí)提升Ca2+濃度，從而促進(jìn)線粒體鈣超載形成以及神經(jīng)細(xì)胞的壞死。

另一種Ca2+攝取和釋放通道是RyRs，RyRs亦由三個(gè)基因編碼，在神經(jīng)細(xì)胞中有一定表達(dá)，雖然表達(dá)程度不及IP3Rs，但其在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)組分Ca2+釋放中有重要作用。RyRs能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+向線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+貯存單位內(nèi)流動，其每次開放孔道通過Ca2+量是IP3Rs的約20倍[24]。在SAH中，RyRs起著介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜偶聯(lián)組分鈣超載的作用。Koide等[30]發(fā)現(xiàn)，SAH中存在細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的減少，可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的降低和RyR2表達(dá)的下降，這證實(shí)了SAH后Ca2+在線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)內(nèi)大量蓄積導(dǎo)致鈣超載的過程。另外，RyR1的遺傳變異可能與SAH后的血管痙攣癥狀有關(guān)[31]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)部位還有許多Ca2+調(diào)節(jié)受體，如肌漿網(wǎng)鈣泵（sarco-endoplasmic reticulum calcium atpase，SERCA）、磷酸集群分類蛋白-2（phosphoacidic cluster sorting protein-2，PACS-2）等。研究認(rèn)為，這些Ca2+調(diào)節(jié)受體在腦損傷中也起著重要作用[32-33]。然而它們在SAH中的作用仍研究甚少。

綜上所述，Ca2+濃度變化是由多種線粒體Ca2+相關(guān)受體共同作用的結(jié)果，這些受體的表達(dá)在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成了一個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能協(xié)調(diào)的細(xì)胞生命過程。各種受體表達(dá)的相互作用共同調(diào)控著細(xì)胞的Ca2+信號通路和細(xì)胞凋亡過程。它們?yōu)镾AH等疾病導(dǎo)致的線粒體鈣超載提供了依據(jù)。在SAH誘發(fā)的線粒體鈣超載過程中，待解決的問題仍有很多。首先，位于線粒體不同位置的受體在鈣信號傳遞過程的分工合作機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。另外，一些Ca2+相關(guān)受體在SAH進(jìn)程中表達(dá)的變化仍不是很明確，尤其是MICU1、MICU2和EMRE這些已明確與SAH相關(guān)的MCU密切關(guān)聯(lián)的受體，有待更深一步去探究。最后，我們需要一個(gè)更加系統(tǒng)的，定量描述相關(guān)蛋白如何募集、組合并隨環(huán)境不同變化的鈣超載網(wǎng)絡(luò)模型，以更好地研究SAH治療的新策略。

1 Fujii M，Yan J，Rolland WB，et al.Early brain injury，an evolving frontier in subarachnoid hemorrhage research[J].Transl Stroke Res，2013，4：432-446.

2 Peng TI，Jou MJ.Oxidative stress caused by mitochondrial calcium overload[J].Ann NY Acad Sci，2010，1201：183-188.

3 薛亮，尹長城.線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，12：014.

4 Nicchitta CV，Williamson JR.Spermine.A regulator of mitochondrial calcium cycling[J].J Biol Chem，1984，259：12 978-12 983.

5 García-Rivas Gde J，Carvajal K，Correa F，et al.Ru360，a specific mitochondrial calcium uptake inhibitor，improves cardiac post-ischaemic functional recovery in rats in vivo[J].Br J Pharmacol，2006，149：829-837.

6 Yan H，Hao S，Sun X，et al.Blockage of mitochondrial calcium uniporter prevents iron accumulation in a model of experimental subarachnoid hemorrhage[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，456：835-840.

7 Yan H，Zhang D，Hao S，et al.Role of mitochondrial calcium uniporter in early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J].Mol Neurobiol，2015，52：1637-1647.

8 Perocchi F，Gohil VM，Girgis HS，et al.MICU1 encodes a mitochondrial EF hand protein required for Ca2+uptake[J].Nature，2010，467：291-296.

9 Mallilankaraman K，Doonan P，Cárdenas C，et al.MICU1 is an essential gatekeeper for MCU-mediated mitochondrial Ca2+uptake that regulates cell survival[J].Cell，2012，151：630-644.

10 Mallilankaraman K，Cárdenas C，Doonan PJ，et al.MCUR1 is an essential component of mitochondrial Ca2+uptake that regulates cellular metabolism[J].Nat Cell Biol，2012，14：1336-1343.

11 Logan CV，Szabadkai G，Sharpe JA，et al.Loss-offunction mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling[J].Nat Genet，2014，46：188-193.

12 Patron M，Checchetto V，Raffaello A，et al.MICU1 and MICU2 finely tune the mitochondrial Ca2+uniporter by exerting opposite effects on MCU activity[J].Mol Cell，2014，53：726-737.

13 Sancak Y，Markhard AL，Kitami T，et al.EMRE is an essential component of the mitochondrial calcium uniporter complex[J].Science，2013，342：1379-1382.

14 Liu JC，Liu J，Holmstr?m KM，et al.MICU1 serves as a molecular gatekeeper to prevent in vivo mitochondrial calcium overload[J].Cell reports，2016，16：1561-1573.

15 Liu G，Wang ZK，Wang ZY，et al.Mitochondrial permeability transition and its regulatory components are implicated in apoptosis of primary cultures of rat proximal tubular cells exposed to lead[J].Arch Toxicol，2016，90：1193-1209.

16 Szabadkai G，Bianchi K，Várnai P，et al.Chaperonemediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+channels[J].J Cell Biol，2006，175：901-911.

17 Li J，Lu J，Mi Y，et al.Voltage-dependent anion channels (VDACs) promote mitophagy to protect neuron from death in an early brain injury following a subarachnoid hemorrhage in rats[J].Brain Res，2014，1573：74-83.

18 Martin LJ，Adams NA，Pan Y，et al.The mitochondrial permeability transition pore regulates nitric oxide-mediated apoptosis of neurons induced by target deprivation[J].J Neurosci，2011，31：359-370.

19 Law AKT，Gupta D，Levy S，et al.TGF-β1 induction of the adenine nucleotide translocator 1 in astrocytes occurs through Smads and Sp1 transcription factors[J].BMC Neurosci，2004，5：1.

20 Schinzel AC，Takeuchi O，Huang Z，et al.Cyclophilin D is a component of mitochondrial permeability transition and mediates neuronal cell death after focal cerebral ischemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：12 005-12 010.

21 Vance JE.Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria[J].J Biol Chem，1990，265：7248-7256.

22 Rusinol AE，Cui Z，Chen MH，et al.A unique mitochondria-associated membrane fraction from rat liver has a high capacity for lipid synthesis and contains pre-Golgi secretory proteins including nascent lipoproteins[J].J Biol Chem，1994，269：27 494-27 502.

23 Achleitner G，Gaigg B，Krasser A，et al.Association between the endoplasmic reticulum and mitochondria of yeast facilitates interorganelle transport of phospholipids through membrane contact[J].Eur J Biochem，1999，264：545-553.

24 Rizzuto R，Brini M，Murgia M，et al.Microdomains with high Ca2+close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria[J].Science，1993，262：744-747.

25 Csordás G，Várnai P，Golenár T，et al.Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface[J].Mol Cell，2010，39：121-132.

26 Kaufman RJ，Malhotra JD.Calcium trafficking integrates endoplasmic reticulum function with mitochondrial bioenergetics[J].Biochim Biophys Acta，2014，1843：2233-2239.

27 Kiviluoto S，Vervliet T，Ivanova H，et al.Regulation of inositol 1，4，5-trisphosphate receptors during endoplasmic reticulum stress[J].Biochim Biophys Acta，2013，1833：1612-1624.

28 Chen T，F(xiàn)ei F，Jiang X，et al.Down-regulation of Homer1b/c attenuates glutamate-mediated excitotoxicity through endoplasmic reticulum and mitochondria pathways in rat cortical neurons[J].Free Radic Biol Med，2012，52：208-217.

29 Kasseckert SA，Shahzad T，Miqdad M，et al.The mechanisms of energy crisis in human astrocytes after subarachnoid hemorrhage[J].Neurosurgery，2013，72：468-474.

30 Koide M，Nystoriak MA，Krishnamoorthy G，et al.Reduced Ca2+spark activity after subarachnoid hemorrhage disables BK channel control of cerebral artery tone[J].J Cereb Blood Flow Metab，2011，31：3-16.

31 Rueffert H，Gumplinger A，Renner C，et al.Search for genetic variants in the ryanodine receptor 1 gene in patients with symptomatic cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage[J].Neurocrit Care，2011，15：410-415.

32 Sun X，Zhong J，Wang D，et al.Increasing glutamate promotes ischemia-reperfusion-induced ventricular arrhythmias in rats in vivo[J].Pharmacology，2014，93：4-9.

33 Arruda AP，Pers BM，Parlakgül G，et al.Chronic enrichment of hepatic endoplasmic reticulummitochondria contact leads to mitochondrial dysfunction in obesity[J].Nat Med，2014，20：1427-1435.