劉金靈陳海龍楊豐宇黃俊廖花

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；3作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；4南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

MAS育種改良秈稻恢復(fù)系‘E32’及其雜交種的稻瘟病抗性

鄒俊鋒1，李永聰1，劉雄倫1，2，3，4*，劉金靈1，2，3，4，陳海龍1，楊豐宇1，黃俊1，廖花1

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；3作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；4南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

利用已克隆的廣譜抗稻瘟病基因Pi9的DNA序列，設(shè)計(jì)功能分子標(biāo)記Ins2-3，通過(guò)標(biāo)記基因型輔助選擇和連續(xù)回交育種實(shí)踐，定向改良秈稻恢復(fù)系E32及其兩系雜交種培矮64S/E32的稻瘟病抗性。獲得以下結(jié)果：Ins2-3是一個(gè)高效共顯性DNA標(biāo)記，在Pi9供體親本75-1-127和受體親本E32基因組中分別擴(kuò)增出一條793 bp和2 kb的穩(wěn)定條帶，Ins2-3的輔助選擇效率達(dá)100%；利用Ins2-3開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇育種，通過(guò)連續(xù)多代回交自交，育成了苗瘟和穗瘟抗性均顯著提高的新恢復(fù)系E32-Pi9，其遺傳背景與受體親本E32一致；用E32 -Pi9配制的兩系雜交種培矮64S/E32-Pi9的稻瘟病抗性，比對(duì)照培矮64S/E32顯著提高，而主要農(nóng)藝性狀及雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)非常相似。

水稻；稻瘟病抗性改良；Pi9基因；分子標(biāo)記輔助選擇

水稻是重要的糧食作物，全球一半以上人口以稻米為主食［1］。然而，作為水稻主要病害的稻瘟?。╮ice blast），可在水稻不同生育時(shí)期造成危害，流行年份可使水稻減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕收［2］。由于多數(shù)雜交稻親本的稻瘟病抗性不強(qiáng)，很大程度上限制了一些強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的推廣應(yīng)用。長(zhǎng)期實(shí)踐表明，發(fā)掘、鑒定和利用廣譜持久抗性基因，選育和推廣抗病品種（組合）是控制稻瘟病害最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的策略［3］。分子標(biāo)記輔助選擇（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）育種可定向改良個(gè)別性狀而不改變受體遺傳背景，且沒(méi)有轉(zhuǎn)基因生物安全性風(fēng)險(xiǎn)，是現(xiàn)代分子育種的重要手段。來(lái)源于小粒野生稻的Pi9基因位于水稻第6號(hào)染色體的Pi2/9位點(diǎn)，與Pi2、Piz-t、Pigm、Pi50、Pi2-2等抗瘟基因互為復(fù)等位基因，是一個(gè)已被成功克隆的廣譜持久抗性基因［4～9］。本研究利用Pi9基因序列設(shè)計(jì)并篩選高效DNA標(biāo)記，并應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)開(kāi)展連續(xù)回交育種，定向改良秈稻恢復(fù)系‘E32’及其雜交種的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Pi9基因供體親本‘75-1-127’，受體親本‘E32’；兩系雜交種‘培矮64S/E32’，改良雜交種‘培矮64S/E32-Pi9’；稻瘟病室內(nèi)接種抗病對(duì)照‘75-1-127’，感病對(duì)照品種‘CO39’；本實(shí)驗(yàn)室收集的來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌小種或菌株25份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 Pi9基因功能分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

Pi9基因含有2個(gè)內(nèi)元，長(zhǎng)度分別為5362 bp和128 bp；cDNA全長(zhǎng)4009 bp，包括3099 bp的編碼區(qū)和910-bp 3′UTR［5］。利用Pi9基因序列信息設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，用候選標(biāo)記分別PCR擴(kuò)增75-1-127和E32基因組，做多態(tài)性分析，篩選出穩(wěn)定高效的多態(tài)標(biāo)記用于MAS育種。

1.2.2 供試水稻材料稻瘟病抗性鑒定及抗譜分析

室內(nèi)接種水稻材料包括Pi9供體親本‘75-1-127’、受體親本‘E32’、改良品系‘E32-Pi9’、感病對(duì)照‘CO39’。供試水稻材料播種于塑料盆中，加入花卉營(yíng)養(yǎng)土于人工氣候室中育苗（26～28℃，正常光照）。4葉期采用單菌株約1×105個(gè)/mL濃度的稻瘟菌孢子懸浮液室內(nèi)噴霧活體接種，26℃黑暗保濕24 h，然后在26～28℃、高濕、正常光照條件下誘導(dǎo)發(fā)病5～7 d。參照Bonman的0～5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情并分類(lèi)［10］（0～2級(jí)為抗病類(lèi)型，3～5級(jí)為感病類(lèi)型），統(tǒng)計(jì)抗性頻率。另外，所有水稻材料2016年5月14日播種于瀏陽(yáng)大圍山病圃，6月中旬調(diào)查苗瘟，9月中旬調(diào)查穗瘟，鑒定田間抗性。

1.2.3 標(biāo)記基因型分析

CTAB法提取水稻葉片總DNA［11］。用獲選多態(tài)分子標(biāo)記對(duì)各DNA樣品做PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（10μL）：DNA模板（約100 ng/μL）1.0μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0μL，10×Buffer 1.0μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2μL，5 U/μL r-Taq酶（大連寶生物）0.1μL，ddH2O 6.7μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，分析帶型（標(biāo)記基因型）。

1.2.4 MAS育種實(shí)踐

2010～2015年在長(zhǎng)沙（夏季）和三亞（冬季），用‘E32’作受體親本及輪回親本、‘75-1-127’作Pi9基因供體親本，雜交及連續(xù)回交自交，開(kāi)展MAS育種實(shí)踐。2015年獲得BC6F3群體，在此基礎(chǔ)上鑒定出含Pi9基因的抗病純系‘E32-Pi9’，同年用兩用不育系‘培矮64S’配制雜交種。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試親本水稻的稻瘟病抗性及抗菌譜

室內(nèi)接種結(jié)果表明，Pi9基因供體‘75-1-127’的抗性強(qiáng)抗譜廣，除了對(duì)來(lái)自日本的小種KOH和來(lái)自韓國(guó)的小種ROR1表現(xiàn)感病外，對(duì)其余來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同稻區(qū)的23個(gè)小種（菌株）均表現(xiàn)高水平抗性，抗性頻率為92.0%；受體親本‘E32’對(duì)11份小種（菌株）表現(xiàn)抗病，對(duì)其余14份小種（菌株）感病，抗性頻率為44.0%，表明‘E32’的稻瘟病抗性水平低、需要改良；感病對(duì)照品種‘CO39’對(duì)所有25份供試小種（菌株）均表現(xiàn)感病，抗性頻率為0（表1）。

表1 供試水稻親本的稻瘟病抗菌譜比較Table1 Resistancespectrumofthetestedriceparents to25M.oryzaeisolates

2.2 高效多態(tài)分子標(biāo)記的獲得

經(jīng)過(guò)反復(fù)設(shè)計(jì)與篩選，獲得了1個(gè)高效的DNA標(biāo)記Ins2-3，該標(biāo)記位于Pi9基因第一個(gè)內(nèi)元，為共顯性分子標(biāo)記。Ins2-3在Pi9基因供體‘75-1 -127’中擴(kuò)增出793 bp的單一穩(wěn)定條帶，在受體親本‘E32’中擴(kuò)增出一條約2 kb的單一穩(wěn)定條帶（圖1）。用Ins2-3在各回交世代開(kāi)展的MAS育種實(shí)踐中，其輔助選擇效率可達(dá)100%（數(shù)據(jù)未發(fā)表），表明Ins2-3是一個(gè)高效可靠實(shí)用的分子標(biāo)記。

2.3 水稻抗病新品系E32-Pi9的鑒定

為了獲得含有Pi9基因的抗病純系，用E32/75 -1-127的BC6F3株系為材料，通過(guò)Ins2-3的單株基因型分析和室內(nèi)接種抗性表型鑒定，篩選出1個(gè)抗病純系‘E32-Pi9’（圖1）。‘E32-Pi9’不僅Pi9基因位點(diǎn)純合，而且主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀也已經(jīng)穩(wěn)定，與受體親本‘E32’的遺傳背景基本一致（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

圖1 抗稻瘟病水稻純系‘E32-Pi9’的鑒定Fig.1 Identificationofricepureline‘E32-Pi9’withhigh-levelblastresistance

2.4 ‘E32-Pi9’及其雜交種的稻瘟病田間抗性

為進(jìn)一步檢驗(yàn)抗病純系‘E32-Pi9’及其雜交種的稻瘟病田間抗性，2016年對(duì)相應(yīng)材料進(jìn)行了病圃自然抗性鑒定。結(jié)果表明，‘E32-Pi9’及其雜交種‘培矮64S/E32-Pi9’均表現(xiàn)出高水平的苗瘟和穗瘟抗性（苗瘟0級(jí)，穗瘟1級(jí)），與供體親本‘75-1-127’的抗性水平相當(dāng)；而相應(yīng)的受體親本‘E32’及其雜交種‘培矮64S/E32’的田間抗性水平低（苗瘟4級(jí)、穗瘟5級(jí)）（圖2）。說(shuō)明用顯性廣譜抗瘟基因Pi9改良水稻稻瘟病抗性是行之有效的。另外，抗病雜交種‘培矮64S/E32-Pi9’的主要農(nóng)藝性狀及雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)，與對(duì)照‘培矮64S/E32’相當(dāng)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

圖2 改良抗病品系‘E32-Pi9’及其雜交種的田間抗性表現(xiàn)Fig.2 Fieldblastresistanceperformanceofimprovedriceline‘E32-Pi9’anditshybrid

3 討論

稻瘟病是水稻的主要病害，抗性育種是解決稻瘟病危害最有效的策略。實(shí)踐證明，Pi9基因（位點(diǎn)）具有廣譜持久抗性，且為顯性遺傳，在雜交水稻稻瘟病抗性育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。水稻稻瘟病抗性是一個(gè)典型的質(zhì)量—數(shù)量性狀，抗病性表型既由基因控制又受環(huán)境影響，因此傳統(tǒng)育種方法很難準(zhǔn)確選擇。而MAS育種不但準(zhǔn)確、高效、安全，而且可以在早期選擇，在抗病性育種中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。另外，高水平的稻瘟病抗性往往是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果，而MAS育種轉(zhuǎn)移的通常是整個(gè)基因位點(diǎn)（基因家族），效果比通過(guò)轉(zhuǎn)基因法導(dǎo)入單個(gè)基因更好，我們的育種實(shí)踐結(jié)果很好地證明了這一現(xiàn)象。

由于稻瘟病菌生理小種（菌株）的多樣性及易變性，往往導(dǎo)致抗病水稻品種在不同稻區(qū)或年份間抗性不一致、不穩(wěn)定，一定程度上限制了抗性基因和抗性品種的推廣應(yīng)用［12］。實(shí)踐證明，將多個(gè)抗菌譜不同的抗瘟基因聚合到同一個(gè)水稻品種中，是培育廣譜持久抗瘟新品種的良策［13，14］。本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在研究和利用另一個(gè)廣譜抗瘟基因Pigm。Pigm與Pi9具有交叉抗菌譜，我們已經(jīng)開(kāi)展包括Pi9、Pigm在內(nèi)的多個(gè)廣譜抗瘟基因的聚合育種，旨在培育出抗譜更廣、抗性更強(qiáng)更持久的水稻新品種（組合）［15～19］。

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Improving Blast Resistance of Rice Restorer‘E32’and Its Hybrid through Molecular Marker-assisted Selection

ZOUJunfeng1，LIYongcong1，LIUXionglun1，2，3，4*，LIUJinling1，2，3，4，CHENHailong1，YANGFengyu1，HUANGJun1，LIAOHua1

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Key Laboratory of Hunan Province for Disease Resistance Breeding of Rice and Rapeseed，Changsha，Hunan 410128，China；3 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；4 Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops，Changsha，Hunan 410128，China）

To improve blast resistance of the indica rice restorer E32 and its hybrid，amolecularmarker，Ins2-3，was developed based on the DNA sequence of the cloned broad-spectrum blast resistance gene Pi9，and marker-assisted selection breeding practicewas implemented in thisstudy.Themain resultswere as follows：Ins2-3 was a co-dominantmarker，showing stable polymorphism between the Pi9 donor 75-1-127 and the receptor E32 by producing a793bp and a 2kb PCR band respectively，and the phenotype selection efficiency bymarkergenotype reached 100%.A new restorer line E32 -Pi9 and its hybrid Peiai64s/E32-Pi9，with high-level seedling and spike blast resistance and unchanged genetic background，were bred.

rice；blast resistance improvement；the Pi9 gene；molecularmarker-assisted selection

S511.034

A

1001-5280（2017）01-0011-04

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2017.01.03

2016 11 28

鄒俊鋒（1987-），男，碩士研究生，Email：zoujunfeng185@163.com；并列第一作者：李永聰（1986-），男，碩士研究生，Email：465655693@qq.com。*通信作者：劉雄倫，教授，Email：xionglun@hunau.edu.cn。

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)（2016ZX08001-002）；湖南省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2015NK1001）。