黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院神經(jīng)外科，北京101149）

3D生物打印技術在腦膠質(zhì)瘤研究中的應用

黃 慶，康慧斌，張洪兵

（首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院神經(jīng)外科，北京101149）

3D生物打印技術是近期在國內(nèi)外興起的一項新的研究技術，已經(jīng)運用到多個醫(yī)學相關領域.腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，該病具有易復發(fā)、預后差的特點，目前仍有許多研究的瓶頸問題和關鍵點難以克服.3D生物打印技術在腦膠質(zhì)瘤研究中的應用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細胞對各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面.本文就近期3D生物打印技術在腦膠質(zhì)瘤研究領域的應用情況做了初步回顧，并就其發(fā)展前景進行了展望.

3D生物打??；腦膠質(zhì)瘤；應用

1 腦膠質(zhì)瘤的流行病學與研究難點

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，據(jù)四川大學華西醫(yī)院王翔等［1］統(tǒng)計，2008～2013年在我國四川省各大醫(yī)院收治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，神經(jīng)上皮來源的腫瘤是第一大類腫瘤，占全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的近1／3，其中，膠質(zhì)母細胞瘤占第一位（38.14%），其次分別為彌漫性星形細胞瘤（15.21%），間變性星形細胞瘤（8.83%），以及毛細胞型星形細胞瘤（6.57%）等.另據(jù)美國腦腫瘤注冊中心（CBTRUS）統(tǒng)計顯示［2］，2009～2013年美國40歲以上人群中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤年發(fā)病率為40.10人／每10萬人，年死亡率為8.89人／每10萬人，其中，最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤為膠質(zhì)母細胞瘤（46.6%），而在19歲以下腦腫瘤患者中，其發(fā)生率可高達47.4%.該病發(fā)病率、死亡率高，治愈率低，具有高度異質(zhì)性，常為浸潤性生長，邊界不清，治療后常常復發(fā)，術后生存期較短，膠質(zhì)母細胞瘤5年存活率僅為5.5%，接受標準化治療的患者中位生存期僅為14.6個月，低級別膠質(zhì)瘤雖然生長緩慢，但有易復發(fā)和向高級別進展的可能，患者生存期3～5年不等.該病易復發(fā)、預后差的難題仍未完全攻克，這主要是由于膠質(zhì)瘤呈浸潤式生長，難以全部切除，而血腦屏障阻礙了大部分藥物進入腫瘤局部發(fā)揮作用的結果.因此，深入分析膠質(zhì)瘤的生物學特性，精準地給予腫瘤定位及相應治療是當前腦膠質(zhì)瘤研究的熱點和難點.

2 腦膠質(zhì)瘤研究的新技術

近十年來，膠質(zhì)瘤的診斷和治療技術得到很大的發(fā)展，產(chǎn)生了包括納米技術［3］、免疫治療技術［4］、3D打印技術［5］、靶向治療技術［6］等在內(nèi)的許多新技術，其中，3D打印技術越來越受到國內(nèi)外學者的重視.

3D打印技術是目前國際上發(fā)展最迅猛的幾項新興技術之一，被認為是引領“第四次工業(yè)革命”的最強推動力［7－8］.近年來，該技術在醫(yī)學領域的應用越來越深入，在生物組織打印、器官模型制作等方面發(fā)展迅速，已有神經(jīng)外科、心臟外科、骨科、肝膽外科、泌尿外科等開始研究制作器官三維立體模型輔助診斷與治療，比如：美國國家醫(yī)療中心專家應用該技術成功構建了先天性心臟病患者的心臟模型，外科醫(yī)生利用此模型在術前對患者復雜的心臟結構進行深入的模擬分析，美國密歇根大學醫(yī)學院研究人員利用該技術3D打印了支氣管支架，并獲得了美國食品藥物管理局（FDA）批準，成功為1名先天性支氣管軟化癥患兒移植了3D打印支氣管支架，近期還有成功打印椎間盤、主動脈瘤、腦動脈瘤等組織器官3D模型的報道［9－12］.在腦膠質(zhì)瘤研究領域，王振等［13］報道了應用3D打印技術治療包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的3例腦干腫瘤的臨床研究報告，他們在術前對患者行頭部CTA和MRI檢查，然后把數(shù)據(jù)導入Mimics軟件中進行3D模型重建，圍繞術區(qū)構建患者腫瘤組織、顱骨、臨近區(qū)域的血管，并以此為基礎設計手術入路，為術者提供了立體直觀的術前評估手段，增加了手術的安全性.

而3D生物打印技術則是在常規(guī)3D打印模型的基礎上應用3D生物打印機制作出含有細胞成分并具有生物學活性的產(chǎn)品，該技術的核心是生物磚，即一種新型的、精準的、具有仿生功能的干細胞培養(yǎng)體系，它是以種子細胞（干細胞、已分化細胞等）、生長因子和營養(yǎng)成分等多組份組成的“生物墨汁”，再結合其他材料層層打印出的產(chǎn)品，經(jīng)打印后培育處理，形成具有生理功能的組織結構［5，13－15］.提出細胞和器官3D打印的“概念之父”是美國克萊姆森大學托馬斯·波蘭教授，他指導自己的博士生、清華大學的徐弢教授通過3D打印技術利用心肌細胞和特定的生物材料成功打印出一顆能夠有節(jié)奏地跳動的心臟；美國韋克福雷斯特大學團隊近期利用3D生物打印技術復制出人造耳朵、骨骼、肌肉等組織器官，成功移植到動物體內(nèi)并保持了生物活性；四川大學華西醫(yī)院康裕建教授團隊采用動物自體的脂肪源性間充質(zhì)干細胞制備出個體化的3D生物打印墨汁，在自主研發(fā)的3D生物血管打印機上成功復制出具有生物活性的恒河猴自體血管，將該血管通過手術移植到動物體內(nèi)，實現(xiàn)了血管的再生.

目前，3D生物打印技術在腦膠質(zhì)瘤研究中的應用還處于初期探索階段，主要集中在腫瘤模型制作并檢測腫瘤細胞對各種抗腫瘤藥物敏感性和耐藥性等方面［16］.腦膠質(zhì)瘤模型的制作對于探討該病發(fā)生、發(fā)展的機制，建立新的治療手段，促進臨床研究的深入發(fā)展都極為重要.理想的膠質(zhì)瘤模型應該具備以下幾個生物學特性和化學特性［17］，即腫瘤的形態(tài)學特征具有高度一致性，各代的移植瘤與初代接種的腫瘤細胞在形態(tài)學、核分裂相、腫瘤間質(zhì)和血管等結構上高度近似；腫瘤的遺傳學特征具有高度一致性，傳代移植的腫瘤細胞染色體與初代接種的腫瘤細胞染色體要高度近似；腫瘤細胞的增殖動力學特征具有高度一致性，各代移植瘤細胞在細胞周期、時相比例、分裂指數(shù)和倍增時間等方面要高度近似；腫瘤的標記物具有高度一致性，移植瘤與初代接種的腫瘤細胞應在一些膠質(zhì)瘤特有生化指標的定性或定量方面保持高度近似；駐瘤模型應具有高度穩(wěn)定性，腫瘤細胞經(jīng)過多次連續(xù)培養(yǎng)傳代后，細胞存活率與移植成功率高，無自然消退等現(xiàn)象.

近年來，國內(nèi)外學者采用多種方式制作了不同的腦膠質(zhì)瘤模型，其中包括：大鼠／小鼠腦膠質(zhì)瘤（C6、9L、T9和F98等細胞株）模型、裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位（U87R細胞株）模型、斑馬魚原位膠質(zhì)瘤（U87R細胞株）模型、低級別腦膠質(zhì)瘤組織塊法原代培養(yǎng)（IDH 1／2突變型膠質(zhì)瘤細胞株）等［18－20］，但上述模型仍不能很好地模擬膠質(zhì)瘤的生物學特性，其中很重要的一個因素即目前絕大多數(shù)的研究層面為二維空間，對于腫瘤細胞的空間分布及其相互作用不能完整體現(xiàn)，不能很好地在體或體外構建膠質(zhì)瘤生物模型，因此，3D生物打印技術被引入腦膠質(zhì)瘤模型研究之中.

3 3D生物打印技術在腦膠質(zhì)瘤研究中的初步應用

通過基于細胞和組織的3D生物打印技術目前主要采用攜帶細胞的水凝膠3D沉積技術，直接攜帶細胞打印這種技術相比于以往在已成型的支架中種植細胞，可以獲得更高的細胞存活率和細胞密度.Dai等［16］近期采用3D生物打印方式成功將膠質(zhì)母細胞瘤干細胞培養(yǎng)放置在明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠的基質(zhì)構建的模型中，發(fā)現(xiàn)3D生物打印細胞培養(yǎng)模式下的膠質(zhì)瘤干細胞存活率為86.92%，這些腫瘤細胞保留了原有的遺傳學特點，還能夠表達出細胞特異性的分子標記，如血管生成因子VEGF，同時具有較高的細胞增殖活性，3D生物打印培養(yǎng)模式的膠質(zhì)瘤干細胞較2D培養(yǎng)模式具有更強的耐藥性.Loess?ner等［21］也成功運用水凝膠材料做為細胞外基質(zhì)，在體外將腫瘤細胞構建成三維模式.不過，由于膠質(zhì)瘤生物模型中存在細胞?細胞間、細胞?基質(zhì)間、時間與空間、代謝梯度、機械阻力等多種因素的相互作用，應用3D生物打印技術復制腦膠質(zhì)瘤模型仍有許多亟待解決的問題，包括：具有多噴頭的3D生物打印機的研發(fā)、作為3D打印基質(zhì)的新一代成型材料的探索、腫瘤打印核心區(qū)域細胞存活率的保持、細胞生物孵化器的改進等.

4 3D生物打印技術的制約因素與發(fā)展展望

3D生物打印機是進行3D細胞生物打印的基礎，目前國內(nèi)外已經(jīng)成型的該類打印機包括：瑞士RegenHU BIOFACTORY細胞生物打印機、Regenvov公司的3D生物打印工作站、新加坡Bio3D Technolo?gies公司的Bio3D Life?Printer細胞生物打印機、邁普MP?BIOPRINT3.0細胞生物打印機、Organovo公司的NovoGen MMXTM細胞生物打印機、藍光英諾的3D生物血管打印機等［5，12，22］.這些打印機主要采用基于噴墨技術的生物打印工藝，具備可任意定制并自動切換的多噴頭系統(tǒng)、多軸運動平臺、多區(qū)段溫度控制與壓力調(diào)控等，將細胞懸液或生物材料作為生物磚（生物墨汁），通過加熱或壓電的方式將打印材料滴出成形，提供細胞生長所需的微環(huán)境，在一定程度上提高了3D打印細胞更高的存活率和結構與功能的穩(wěn)定性，但這些設備在生物打印細胞過程中的可操控性和機械穩(wěn)定性仍有待進一步提升.

作為細胞外基質(zhì)的生物材料是影響3D腫瘤生物打印的關鍵因素之一［23］，細胞外基質(zhì)形成三維多孔支架空間，提供力學支撐，使腫瘤細胞增殖、分化、遷移和粘連，促進細胞長入、基因表達.理想的生物材料應該具備良好的生物相容性、生物響應性、降解性能和力學特性等，能夠滿足腫瘤細胞的3D成型支撐，保證模型表面或核心的細胞具有很高的存活率，目前最常用的明膠／海藻酸／纖維蛋白原水凝膠基質(zhì)可以初步滿足3D細胞生物打印要求，但打印在基質(zhì)中的細胞與細胞之間的聯(lián)系受到一定的影響，天壇醫(yī)院張東團隊與我們近期共同進行的研究初步發(fā)現(xiàn)將干細胞打印種植于海藻酸鹽基質(zhì)表面較種植于該基質(zhì)中具有更高的細胞存活率，提示目前常用的3D打印基質(zhì)仍有很大的缺陷，尤其是該基質(zhì)在模型后期的支撐性及其對鈣離子的依賴性對于細胞活性的影響仍有待進一步解決，因此，尋找新的3D成型支撐材料是該模型研究的關鍵點之一.

腫瘤模型打印后，需要置入細胞生物孵化器中進一步培育，這種生物孵化器應高度近似于腫瘤體內(nèi)生長微環(huán)境，含有各種理化成份與生長因子，由此孕育出的腫瘤模型才能夠更接近體內(nèi)腫瘤.美國NASA發(fā)明了一種旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，通過模擬微重力，將細胞維持在一個動態(tài)的懸液環(huán)境，獲得低剪切力的培養(yǎng)環(huán)境，這是一種全新的體外三維細胞培養(yǎng)模式，該系統(tǒng)較靜態(tài)培養(yǎng)和其他動態(tài)培養(yǎng)方式更容易使細胞分化和維持三維立體結構，有利于目標細胞聚集生長為類似體內(nèi)的組織結構.而目前國內(nèi)還沒有產(chǎn)生自主知識產(chǎn)權的細胞生物孵化器，完全依賴于國外的同類產(chǎn)品.

因此，3D生物打印技術應用于腦膠質(zhì)瘤的研究仍任重而道遠，生物材料學的進步、細胞生物孵化器的改進、3D生物打印機的發(fā)展是其中幾個制約發(fā)展的關鍵因素，在今后的研究中，如果能與包括納米技術、人工智能技術、醫(yī)學仿生工程技術等在內(nèi)的其他新興技術相結合，該技術將會有更廣闊的發(fā)展空間.

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Application of 3D bioprinting technology in the research of glioma

HUANG Qing，KANG Hui?Bin，ZHANG Hong?Bing
Department of Neurosurgery，Beijing Luhe Hospital，Capital Med?ical University，Beijing 101149，China

The technology of 3D bioprinting is a new research technique in recent years，and it has been applied to many medical fields.Glioma is one of the most common intracranial tumor，and it has the characteristics of easy recurrence and poor prognosis.There are still many bottlenecks and key points which cannot be overcomed.The application of 3D bioprinting in the study of glioma is still in the initial stage of exploration.And it mainly focuses on simulating the tumor models and detecting the sensitivity and drug resistance of the tumor cells for antineoplastic drugs.This review preliminarily focuses on the aspect of 3D bioprinting，which has been applied in the study of glioma，and provides the prospect for its development.

3D bioprinting；glioma；application

R739.41

A

2095?6894（2017）07?61?03

2017－05－11；接受日期：2017－05－26

首都臨床特色應用研究與成果推廣項目（Z171100001017044）；北京市通州區(qū)科技計劃項目國自然攻堅專項（KJ2017CX039?10）；北京市通州區(qū)衛(wèi)生發(fā)展科研專項重點課題（TWKY?2016?ZD?01?10）

黃 慶.博士，主任醫(yī)師，副教授.研究方向：神經(jīng)外科.E?mail：doctor＿huang＠163.com