鄭云貴，盧曉聞，許烈鵬，李欽喜，涂艷陽，袁 軍

（1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東汕頭515041；2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

腦膠質(zhì)瘤的基因治療研究進展

鄭云貴1，盧曉聞1，許烈鵬1，李欽喜1，涂艷陽2，袁 軍1

（1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東汕頭515041；2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其呈浸潤性生長，具有惡性程度高、浸潤性強、預(yù)后差等特點.雖然手術(shù)切除、化療和放療方法已經(jīng)取得迅猛發(fā)展，但目前腦膠質(zhì)瘤患者的臨床預(yù)后仍然較差.在過去的二十多年間，基因治療作為一種治療腦膠質(zhì)瘤的新型且有效的方式，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床前及臨床試驗.目前常用的基因治療方式包括：自殺基因治療、免疫基因治療、溶瘤病毒治療、抑癌基因治療、抗血管生成因子治療和microRNAs介導(dǎo)的基因治療.本文將介紹目前用于腦膠質(zhì)瘤治療的基因療法.

腦膠質(zhì)瘤；基因治療；臨床試驗

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤［1］，約占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的40%～50%［2］.腦膠質(zhì)瘤大多呈膨脹性或浸潤性生長，且常與正常腦組織無明顯界限，故其惡性程度高、預(yù)后差.據(jù)統(tǒng)計，腦膠質(zhì)瘤患者的五年總生存率低于30%［3］，病理級別為Ⅳ級的患者，中位生存期僅為1年左右［4］.目前，腦膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)切除腫瘤為主聯(lián)合術(shù)后放化療作為輔助療法.雖然手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療使腦膠質(zhì)瘤患者的臨床預(yù)后得到改善［3］，但因存在放化療造成腫瘤細胞耐受及腫瘤內(nèi)難以達到有效化療藥物濃度等問題，故手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合術(shù)后放化療無法達到治愈腦膠質(zhì)瘤的目的.

為了解決手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合術(shù)后放化療無法治愈腦膠質(zhì)瘤的問題，近年來，基因治療腦膠質(zhì)瘤的新方法成為國內(nèi)外研究的熱點.自1992年開展第一個基因治療腦腫瘤的臨床試驗以來，通過對基因功能的深入探索及對基因把控能力的提高，基因療法已經(jīng)得到迅猛發(fā)展.腦膠質(zhì)瘤與其他癌癥的不同之處在于，由于存在血腦屏障，因此腦腫瘤細胞一般局限于腦內(nèi)而很少發(fā)生腦外轉(zhuǎn)移［5］，因此，它很適合采用基因的目的靶點治療方法進行針對性治療.

1 基因治療的一般定義及常用基因載體

基因治療是指把外源性功能基因?qū)肽康陌屑毎?，以此來糾正因基因異常、缺失引起的細胞功能異常或提供一個新的基因功能，從而達到治療疾病的目的［6］.基因是否能在靶細胞中安全、有效、精準(zhǔn)轉(zhuǎn)染是基因治療的關(guān)鍵，因此，理想的基因載體應(yīng)具備以下特點［7］：①不與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生作用；②保證目的基因在到達靶細胞前不會發(fā)生任何降解；③足夠小，能夠通過細胞膜；④將目的基因安全送達細胞核，并被表達.目前基因治療的常用載體有兩種：病毒載體與非病毒載體.病毒載體因具有高效的基因轉(zhuǎn)染功能、持久的基因表達等特點得到廣泛運用，但又因其具有天然的免疫原性及致癌性而存在安全隱患、靶細胞特異性差、制備費用高、基因容量小等問題，制約了其在基因治療中的運用［8］.非病毒載體雖然制造價格低廉，高效、基因容量大，加之其不具備天然的免疫原性、毒性小而較病毒載體安全等優(yōu)點，但也因其基因轉(zhuǎn)染功能低效、短暫的基因表達等特點而制約了其在基因治療中的運用［8］.

2 腦膠質(zhì)瘤基因治療的現(xiàn)狀

目前，腦膠質(zhì)瘤的基因治療方法主要有以下幾種：自殺基因治療、免疫基因治療、溶瘤病毒治療、抑癌基因治療、抗血管生成因子治療以及近年來興起的micro?RNAs基因療法.

2.1 自殺基因治療自殺基因治療是目前治療腦膠質(zhì)瘤最常用的基因療法［5］.其是通過把具有“前藥轉(zhuǎn)化酶”功能的病毒或細菌基因轉(zhuǎn)染進腫瘤細胞中，然后利用基因表達出來的“前藥轉(zhuǎn)化酶”將細胞內(nèi)無毒或毒性較低的“前藥系統(tǒng)”分解成為具有特定活性的毒性代謝物，從而引起腫瘤細胞死亡［9］.另外，此種治療方式還具有“旁觀者效應(yīng)”，即不僅被轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞會死亡，周圍未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞也會因毒性代謝物的積累［9］或通過被轉(zhuǎn)染腫瘤細胞與未被轉(zhuǎn)染細胞的細胞間接觸或縫隙連接功能促進凋亡［5］.目前研究最多的自殺基因療法是單純皰疹病毒胸苷激酶／戊環(huán)鳥苷（herps simplex virus thymidine kinase／ganciclovir，HSV?tk／GCV）系統(tǒng)及胞嘧啶脫氨酶／5?氟胞嘧啶（cytosine deaminase／5?fluorocytosine，CD／5?FC）兩大系統(tǒng).

1986年，Moolten等［10］首次報道了HSV?tk可用于基因治療，其能夠使被轉(zhuǎn)染的細胞對如GCV、無環(huán)鳥苷（acyclovir，ACV）等核苷類似物更為敏感.在正常人體內(nèi)，GCV的代謝極慢且無毒性，但在HSV?tk的作用下，GCV通過內(nèi)源性激酶加速代謝成為磷酸化的GCV［5］.磷酸化的GCV作為DNA聚合酶的抑制劑，能阻礙DNA的復(fù)制及阻止細胞分裂［10－11］，并利用HSV?tk／GCV的細胞毒性作用來引起細胞凋亡或死亡.多項Ⅰ期及Ⅱ期的臨床試驗結(jié)果［12－13］表明，運用HSV?tk／GCV基因療法治療腦膠質(zhì)瘤是安全可靠的.但在一項大宗Ⅲ期惡性膠質(zhì)瘤的臨床試驗研究中，將248例新診斷為惡性膠質(zhì)瘤并行手術(shù)和放射治療的患者分為基因組（n＝124）和對照組（n＝124），然后通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vector，RV）將HSV?tk基因轉(zhuǎn)染進基因組患者腫瘤細胞中作為手術(shù)聯(lián)合放療的輔助療法，隨后進行4年的隨訪，雖然結(jié)果顯示此種療法是安全的，但兩組患者的腫瘤進展和總體生存率無明顯差異［14］.研究認為，這可能與RV的低轉(zhuǎn)染率有關(guān)［5］，因此，提高基因療法的轉(zhuǎn)染效率十分有必要.腺病毒載體具有更好的轉(zhuǎn)染效率及感染增殖及非增殖細胞的潛在功能，可能會提高轉(zhuǎn)染的效率［11］.在一項利用腺病毒載體進行治療的11例腦膠質(zhì)瘤患者中，有10例患者在首次診斷為惡性腦膠質(zhì)瘤后，生存期＞52周，11例患者的平均總體生存期達112.3周［12］，是利用傳統(tǒng)治療方式時期望生存期的2倍.另外一項通過腺病毒作為載體的體內(nèi)研究試驗中，把HSV?tk／GCV導(dǎo)入腫瘤細胞中，結(jié)果顯示，腫瘤細胞發(fā)生了明顯的凋亡及壞死，這表明腺病毒作為載體介導(dǎo)的HSV?tk／GCV在殺傷腫瘤細胞方面具有強大的功能［15］.腺病毒作為自殺基因療法的載體，在腦膠質(zhì)瘤自殺基因治療方面發(fā)揮著重要的作用，期待后續(xù)有更為深入的研究成果.

CD／5?FC是研究較多的另外一種自殺基因療法.CD能夠?qū)⒖拐婢幬??FC轉(zhuǎn)化為具有高毒性、抗腫瘤的復(fù)合物5?氟尿嘧啶（5?fluorouracil，5?FU）.5?FU能夠不可逆地抑制胸苷酸合成酶和阻止 DNA合成［16］.類似于HSV?tk／GCV基因療法，5?FU也是利用CD／5?FC基因療法的細胞毒性作用機制引起細胞凋亡或死亡［17］.但相對于 HSV?tk／GCV基因療法，CD／5?FC基因療法在一個僅被轉(zhuǎn)染4%的結(jié)直腸移植瘤模型中即發(fā)揮出了強大的抗腫瘤作用［18］.因為5?FU是一個小分子顆粒，它能夠在被轉(zhuǎn)染細胞及周邊細胞的細胞內(nèi)外自由擴散，因此，無需細胞間接觸或縫隙連接的功能就能發(fā)揮出強大的“旁觀者效應(yīng)”.早期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)制缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)的CD／5?FC基因療法可以明顯提高大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的生存期.Kurozumi等［17］通過腺病毒載體將CD／5?FC基因?qū)肴四X膠質(zhì)瘤細胞中，通過流式細胞術(shù)檢測分析得出，CD／5?FC基因療法能促進人腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡，進一步肯定了CD／5?FC基因療法在治療腦膠質(zhì)瘤方面發(fā)揮著重要的作用.近期，一項利用第二代非裂解性逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制載體（Toca 511）介導(dǎo)CD／5?FC基因治療大鼠的腦膠質(zhì)瘤模型的研究［19］結(jié)果顯示，鼠的腦膠質(zhì)瘤模型生存期明顯延長，同時沒有出現(xiàn)任何與治療相關(guān)的毒性副作用.另外，研究者在如何提高CD／5?FC基因療法治療腦膠質(zhì)瘤效率方面也做了許多嘗試.在惡性腦腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，不存在于人細胞中的尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（uracil phosphoribo?sy transferase，UPRT）能夠直接將5?FU轉(zhuǎn)化為磷酸化的 5?氟尿苷（5?fluorouridine，5?FUR），從而加強CD／5?FC基因療法的細胞毒性作用.這表明，聯(lián)合運用CD和UPRT在抗腫瘤治療中具有協(xié)同作用.Kam?bara等［20］在一項腦膠質(zhì)瘤動物模型的實驗中也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合運用CD／5?FC和UPRT可以改善常規(guī)放療的效果，進一步肯定了CD／5?FC和UPRT在抗腫瘤方面的協(xié)同作用.Kaliberov等［16］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)制缺陷型腺病毒載體編碼的突變型細菌CD基因可以提高5?FC的親和力，這種重組的CD基因聯(lián)合電離放射在腦膠質(zhì)瘤異體種植模型中發(fā)揮著強大的腫瘤殺傷能力，并能夠抑制腫瘤的增殖.CD／5?FC基因療法在治療腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要的作用，但仍需進行更多的探索，以尋求更加安全、有效、特異的CD／5?FC基因療法策略.

2.2 免疫基因治療腫瘤組織學(xué)分析顯示，部分免疫反應(yīng)是針對腫瘤細胞而發(fā)生的［21］.通過這種方式，免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，并在控制疾病的進展過程中扮演著重要的角色［21］.但是，大多數(shù)腫瘤細胞（如腦膠質(zhì)瘤細胞）卻具有“免疫赦免”的特殊能力［11］，使得免疫系統(tǒng)無法對其做出有效的免疫應(yīng)答，從而阻礙免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長的作用.而免疫基因療法是依靠轉(zhuǎn)染進腫瘤細胞中的細胞因子或共刺激分子基因的大量表達來提高腫瘤細胞的免疫原性，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞.目前常用的免疫基因療法主要有細胞因子療法、腫瘤疫苗療法以及近年興起的嵌合抗原受體 T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T?Cell immunotherapy，CAR?T）.

細胞因子療法的原理是使用表達白細胞介素?2（interleukin?2，IL?2）、IL?4、IL?12、γ?干擾素（interfer?on?γ，IFN?γ）、β?干擾素（interferon?β，IFN?β）等免疫調(diào)節(jié)細胞因子來轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，從而利用腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的免疫調(diào)節(jié)細胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用.研究發(fā)現(xiàn)，原位IL?4的表達可以引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡.動物模型腦腫瘤細胞分泌的具有嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，如IL?2、IL?12、IFN?γ等，也在腦腫瘤的衰退中起著重要的作用［22］.IFN?β是具有多種抗癌功效的潛在細胞因子，具有直接抗細胞增殖和通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮間接抗癌的作用.在2000年，日本名古屋大學(xué)的研究小組就開始使用細胞因子進行基因治療.根據(jù)實驗和臨床前研究的方法，通過陽離子脂質(zhì)體來轉(zhuǎn)導(dǎo) IFN?β基因.體外試驗表明，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的人 IFN?β不是通過抑制細胞反應(yīng)，而是通過誘導(dǎo)殺傷細胞來轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的，即使是在干擾素抵抗的人膠質(zhì)瘤細胞系，也可能是通過誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)的［23］.把人的膠質(zhì)瘤細胞種植進入裸鼠的腦內(nèi)或皮下的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，局部使用含有人IFN?β基因的陽離子脂質(zhì)體后可明顯抑制腫瘤生長、使自然殺傷（NK）細胞活化及延長患者生存期.基于以上研究成果，IFN?β的Ⅰ期臨床試驗在5例復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的患者中開展［24］.這項臨床實驗結(jié)果顯示，對比同期運用傳統(tǒng)治療方法治療的患者，納入研究的5例患者的中位生存期明顯延長，同時，這項實驗的臨床毒性也很小.在進行基因治療后，患者體內(nèi)與免疫反應(yīng)、細胞凋亡和新生血管有關(guān)的組織和基因表達都發(fā)生了顯著改變［25］，該發(fā)現(xiàn)為IFN?β基因治療的Ⅱ期臨床試驗提供了重要的基礎(chǔ).近期報道了一項利用腺病毒載體介導(dǎo)人IFN?β治療腦膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床試驗［26］，即在11例腦膠質(zhì)瘤患者行手術(shù)切除后給腫瘤內(nèi)及瘤周正常腦組織注射載體，結(jié)果顯示載體的劑量與腫瘤細胞的凋亡及壞死明顯相關(guān)，但高劑量注射則會引起與治療相關(guān)的意識變化（如意識模糊），這提示在行Ⅱ期臨床試驗時，需注意與治療有關(guān)的副作用.

腫瘤疫苗療法也是目前用于治療腦膠質(zhì)瘤常用的免疫基因療法.樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）疫苗就是腫瘤疫苗的一種［27］，它是目前免疫系統(tǒng)中最有效的抗原遞呈細胞，并已經(jīng)被當(dāng)做疫苗載體投入運用.通過將從患者的血清或腫瘤細胞中提取的樹突狀細胞暴露于目的腫瘤所表達的抗原中后，回注入患者體內(nèi)，利用樹突狀細胞的抗原遞呈作用來激活CD8＋T細胞來攻擊腫瘤細胞［27］.早期，Yu等［28］納入7例腦膠質(zhì)瘤患者進行了DC疫苗治療腦膠質(zhì)瘤的Ⅰ期臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有4例患者體中的DC疫苗能激發(fā)全身毒性反應(yīng)，在隨后的二次手術(shù)時，發(fā)現(xiàn)4例患者中有2例患者的腦膠質(zhì)瘤細胞能檢測到強烈的細胞毒性及記憶T細胞浸潤，這項研究表明，DC疫苗治療腦膠質(zhì)瘤是安全、有效、可行的.近年多項關(guān)于DC疫苗治療腦膠質(zhì)瘤的臨床Ⅰ期與Ⅱ期研究也證明了DC疫苗治療腦膠質(zhì)瘤是安全有效的［29－31］.

CAR?T：T細胞是免疫系統(tǒng)里發(fā)揮腫瘤殺傷作用的主要細胞，其主要依靠T細胞受體（T cell recep?tors，TCRs）聯(lián)合存在于抗原遞呈細胞（antigen?pres?enting cell，APC）表面的能識別細胞表面抗原的MHC分子來發(fā)揮作用［32］.由于人體細胞中內(nèi)源性的腫瘤特異T細胞很少或活性較低，因此，應(yīng)用激活細胞內(nèi)的T細胞免疫應(yīng)答來發(fā)揮抗腫瘤作用的策略出現(xiàn)了自身局限性［33］.此外，有效的腫瘤抗原誘導(dǎo)的T細胞活化有時會受T細胞受體對肽／MHC復(fù)合物親和力低或腫瘤細胞自身具有下調(diào)表達MHC習(xí)慣的影響.而CAR?T的T細胞活化與MHC無關(guān)［34］，它是通過從患者身上提取T細胞，然后通過慢病毒等載體對其進行轉(zhuǎn)染，使其能高效表達對腫瘤表面抗原具有特異性親和力的修飾性T細胞受體并以此來發(fā)揮特異性抗腫瘤的作用［34－35］.雖然目前有關(guān)CAR?T細胞的實驗研究仍處于初級階段，且主要集中在白血病等血液腫瘤上，但隨著腫瘤免疫學(xué)的進步，近年，有關(guān)CAR?T細胞治療實體腫瘤如腦膠質(zhì)瘤的實驗研究也相繼開展.目前有關(guān)CAR?T細胞治療腦膠質(zhì)瘤的臨床前試驗已經(jīng)取得了可喜的效果.Shen等［36］研究結(jié)果顯示，針對靶向EGFRvⅢ的CAR?T細胞能有效殺死腦膠質(zhì)瘤細胞.同樣，Miao等［37］也利用針對靶向EGFRvⅢ的CAR?T細胞來治療大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向EGFRvⅢ的CAR?T細胞能夠明顯抑制腫瘤的生長，并提高大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的生存期.Krebs等［38］報道了將IL13Rα2作為靶向的CAR?T細胞治療腦膠質(zhì)瘤動物模型的研究，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤動物模型的生存期獲益.目前，有關(guān)CAR?T細胞治療腦膠質(zhì)瘤動物模型的研究較多，但有關(guān)其的臨床試驗研究仍然較少.2015年，Brown等［39］報道了第一個針對靶向 IL13Rα2的 CAR?T細胞治療復(fù)發(fā)性GBM的臨床研究，研究結(jié)果肯定了CAR?T細胞在復(fù)發(fā)GBM的臨床治療過程中發(fā)揮的重要作用.隨后，在2016年，Brown等［40］又報道了一例利用針對靶向IL13Rα2的CAR?T細胞治療復(fù)發(fā)性GBM的患者.在進行了7.5個月的靶向IL13Rα2的CAR?T細胞治療后，該患者行檢查后發(fā)現(xiàn)，頭顱MRI及PET檢查未發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)及脊柱內(nèi)殘存腫瘤.但該患者在治療后的第228天時，腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā).在腦內(nèi)4個新的位置發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞.引起腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的原因尚在研究中，但初步研究結(jié)果認為，復(fù)發(fā)與腦膠質(zhì)瘤細胞下調(diào)IL13Rα2表達有關(guān)［40］.后續(xù)隨訪發(fā)現(xiàn)，在治療后的第284天檢查時，轉(zhuǎn)移至脊柱的腫瘤細胞也未見復(fù)發(fā).雖然CAR?T細胞療法在治療腦膠質(zhì)瘤中具有可期的前景，但其在治療中存在的一些如脫靶效應(yīng)、“細胞因子風(fēng)暴”、過敏等不良反應(yīng)仍然在一定程度上制約了該療法廣泛應(yīng)用于臨床治療.我們期待有更多對CAR?T細胞治療腦膠質(zhì)瘤及其不良反應(yīng)的相關(guān)研究，為腦膠質(zhì)瘤的免疫基因治療提供更多策略.

2.3 溶瘤病毒基因治療目前研究發(fā)現(xiàn)，天然病毒的致病力較低，因此有了利用基因工程技術(shù)對其進行基因改造成特殊的溶瘤病毒，這種溶瘤病毒能特異性識別并感染腫瘤細胞，并在腫瘤細胞內(nèi)大量復(fù)制，進而摧毀腫瘤細胞.自1991年Martuza首次報道了利用轉(zhuǎn)基因HSV治療惡性腦膠質(zhì)瘤有一定的療效以來，有關(guān)溶瘤病毒治療腦腫瘤的研究受到廣泛的關(guān)注.HSV與腺病毒是目前研究最多的溶瘤病毒.

HSV是一種具有天然神經(jīng)細胞親和力的雙鏈DNA病毒，它在分裂及不分裂的細胞中均具備復(fù)制能力［11］.2000年，Martuza等［41］發(fā)現(xiàn)了一種可復(fù)制性HSV病毒——G207.它在神經(jīng)毒性基因γ134.5的復(fù)制過程中發(fā)生突變，并破壞編碼基因的核糖核苷酸還原酶.臨床前研究發(fā)現(xiàn)，G207可以抑制腦膠質(zhì)瘤的生長，并在非人類靈長動物中具有良好的耐受性.2000年，一項納入21例復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)母細胞瘤患者進行有關(guān)G207劑量安全性及有效性的Ⅰ期臨床研究［42］表明，在21例患者中，無患者出現(xiàn)劑量毒副作用，有8例患者出現(xiàn)腫瘤體積縮小，2例患者的生存期明顯延長.有關(guān)另外一種僅在γ134.5基因中突變的HSV?1716的安全性及有效性的Ⅰ期臨床研究［43］表明，在納入的9例復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者中，不僅無患者出現(xiàn)毒副作用，而且HSV?1716被證實在腫瘤細胞中大量復(fù)制.在隨后進行的HSV?1716Ⅱ期臨床試驗［44］中發(fā)現(xiàn)，在納入的12例腦膠質(zhì)母細胞瘤患者中，有2例患者的腫瘤組織中能檢測到HSV特異性抗原.近年來，F(xiàn)riedman等［45］采用嵌合HCMV／HSV1溶瘤病毒來探討其在常氧和缺氧狀態(tài)下治療腦膠質(zhì)瘤的效果，結(jié)果顯示，該溶瘤病毒在殺傷腦膠質(zhì)瘤細胞方面具備一定的功效，進一步證實了溶瘤病毒HSV在治療腦膠質(zhì)瘤中具有一定效果.

腺病毒是一種無包膜的DNA病毒，能夠感染分裂和不分裂的細胞［11］.ONYX?015是一種可復(fù)制性腺病毒，它可以結(jié)合并抑制宿主細胞表達p53蛋白.研究認為，具有表達p53蛋白的腫瘤細胞不支持ON?YX?015病毒在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制，而不表達p53蛋白的腫瘤細胞則支持ONYX?015在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制.臨床前研究發(fā)現(xiàn)，ONYX?015能引起異體移植人腦膠質(zhì)瘤細胞的溶解，并抑制腫瘤的生長.在隨后進行的ONYX?015Ⅰ期臨床研究［46］中，利用ONYX?015感染腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤細胞，結(jié)果顯示，在納入的24例患者中，無患者腫瘤中出現(xiàn)明顯的細胞溶解，同時，23例患者病情惡化.但這項研究結(jié)果顯示，在12例進行最大劑量感染的患者中，有3例患者的生存期達到了19個月，這表明ONYX?015在腦膠質(zhì)瘤的治療中仍具有一定的效果.

2.4 抑癌基因治療抑癌基因是人體正常細胞存在的基因，它們被激活后能產(chǎn)生抑制細胞增殖及遷移，促進細胞分化的作用，并能夠?qū)毎纳L周期進行負調(diào)控［21］.一旦抑癌基因發(fā)生突變或者丟失，則會失去調(diào)控細胞生長的功能，從而引發(fā)腫瘤［21］.研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腦膠質(zhì)瘤患者細胞中表達p53基因、p16基因、PTEN基因、Rb基因、p12ARF等的抑癌基因發(fā)生突變或丟失，因此，抑癌基因療法成為治療腦膠質(zhì)瘤研究的熱點之一.

P53基因是目前研究最多的抑癌基因，其具有調(diào)控細胞周期、損傷后的DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細胞凋亡的強大功能［11］.作為腦膠質(zhì)瘤最常見的突變基因之一，p53基因的失活在腦膠質(zhì)瘤的進展中起著重要的作用.據(jù)報道［47］，p53基因在惡性腦膠質(zhì)瘤中的突變率達35%～60%.早期，K?ck等［48］研究發(fā)現(xiàn)，利用免疫缺陷型重組腺病毒編碼的外源性野生型p53替代突變的p53基因后，蛋白印跡分析法顯示，腦膠質(zhì)瘤細胞株高表達p53蛋白.隨后進行裸鼠試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用體外轉(zhuǎn)染野生型p53基因可能會抑制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生［48］.2003年，安德森醫(yī)療中心的研究團隊利用腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療方法對15例復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者進行治療.在行腫瘤切除術(shù)后，給腫瘤內(nèi)注射表達p53基因的腺病毒載體［12］，結(jié)果顯示，外源性的p53可以激活下游效應(yīng)，并誘導(dǎo)細胞的凋亡，臨床毒性也較小.但其臨床效果不佳，因為這種方法能轉(zhuǎn)染的細胞范圍較窄（注射部位周圍5 mm）.相關(guān)研究認為，這可能與對腺病毒載體以下問題認識不足有關(guān)：①載體本身的免疫原性限制了其在治療方面的作用；②腺病毒進入細胞所依賴的柯薩奇腺病毒受體（Coxsackie and adenovirus receptor，CAR）在腦膠質(zhì)瘤細胞中較少表達；③腺病毒載體的低轉(zhuǎn)染率.因此，后續(xù)進行臨床試驗時，應(yīng)尋找具有更高轉(zhuǎn)染效率的載體，以優(yōu)化試驗.另外，也有不少研究探索了p53基因在基因治療過程中的輔助作用.Mitlianga等［49］研究在腦膠質(zhì)瘤細胞中同時轉(zhuǎn)染外源性p53和腺病毒AD5Delta24，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中p53基因含量與細胞凋亡無關(guān)，但p53基因與腺病毒AD5Delta24的協(xié)同作用卻促進了腫瘤細胞的死亡.Ito等［50］研究結(jié)果顯示，p53基因誘導(dǎo)的細胞凋亡調(diào)控因子（p53 upregu?lated modulator of apoptosis，PUMA）在轉(zhuǎn)染攜帶p53的腺病毒載體后，能促進突變p53基因?qū)盒阅X膠質(zhì)瘤細胞的吞噬作用及促進腫瘤細胞凋亡.

P16基因是另外一種抑癌基因，它可以讓Rb蛋白處于低磷酸化狀態(tài)，從而使得細胞周期停滯在G1?S周期，阻止細胞生長［51］.p16基因的失活在許多腦腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起著重要的作用，而在腦膠質(zhì)瘤中，超過50%的腫瘤細胞中的p16基因處于失活狀態(tài).研究發(fā)現(xiàn)，用外源性野生型p16基因替代失活的p16基因可以有效抑制惡性腦膠質(zhì)瘤的生長.Nal?abothula等［52］等利用PCR技術(shù)將p16基因植入腦膠質(zhì)瘤細胞中，并使其重新表達，結(jié)果顯示，重新表達的p16基因能夠誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細胞死亡.

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號通路的激活會調(diào)控細胞周期進展，促進腫瘤的發(fā)生.而PTEN基因作為抑癌基因，它能對PI3K進行負調(diào)控［51］.在腦膠質(zhì)瘤中，有40%～50%的腫瘤細胞中會出現(xiàn)PTEN基因的失活，從而導(dǎo)致PI3K異常活化并激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起腫瘤的發(fā)生.Lu等［53］的研究結(jié)果顯示，GBM細胞中PTEN基因的表達可以促進腫瘤細胞凋亡，削弱腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力.Shim等［54］將外源性野生型PTEN轉(zhuǎn)染進PTEN突變的腦膠質(zhì)瘤細胞中，結(jié)果顯示腫瘤細胞的生長明顯受抑制，進一步通過流式細胞儀分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞停滯在G1期.另外，也有相關(guān)報道稱，有PTEN基因表達的兒童腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后明顯較無表達PTEN基因的患者好，這進一步肯定了PTEN基因在腦膠質(zhì)瘤中扮演著重要的角色.

2.5 micro?RNAs介導(dǎo)的基因治療Micro?RNAs是一種具有約22個核苷酸長度的小的非編碼RNA分子［55］，它能在細胞的轉(zhuǎn)錄后階段通過結(jié)合mRNA和抑制翻譯的方式調(diào)控細胞行為及基因表達.自1993年發(fā)現(xiàn)第一個micro?RNA以來，至今，通過各種方式發(fā)現(xiàn)的 micro?RNAs已有數(shù)百種.研究認為，micro?RNAs是真核細胞生物維持正常細胞功能的基礎(chǔ)［56］，它們在基因表達的調(diào)控及許多腫瘤的病理生理過程中均起著重要的作用［56］.自2005年Chan等［57］發(fā)表了第一個有關(guān)micro?RNA（microRNA?21）表達水平與腦膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究后，有關(guān)microRNA表達異常與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展關(guān)系的相關(guān)研究拉開了序幕［58］.至今已發(fā)現(xiàn)了與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)表達上調(diào)的mi?cro?RNAs有33種、表達下調(diào)的micro?RNAs有40種.另外，近期又發(fā)現(xiàn)了18種新的micro?RNAs及16種新型micro?RNA?3p.

2005年，Chan等［57］發(fā)表了第一個表達上調(diào)的microRNA（microRNA?21）與腦膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究，結(jié)果顯示，①相對于正常嬰兒及成年腦組織、培養(yǎng)的正常腦膠質(zhì)瘤細胞，microRNA?21在人的腦膠質(zhì)母細胞瘤組織、培養(yǎng)的早期腦膠質(zhì)瘤及建立的六種腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系（A172，U87，U373，LN229，LN428和LN308）中的表達水平明顯上升；②抑制體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細胞中microRNA?21的表達水平可以激活caspases，并導(dǎo)致細胞凋亡加速.隨后，有關(guān)表達上調(diào)的microRNA促進腦膠質(zhì)瘤進展的研究引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注.Gabriely等［59］發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達上調(diào)的microRNA?10b可以通過拮抗促凋亡基因的表達來促進腫瘤進展.Chen等［60］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，microRNA?27b在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)，通過下調(diào)microRNA?27b的表達可以減緩腫瘤的生長速度，削弱腫瘤的浸潤能力，同時還可以促進腫瘤細胞的凋亡.在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)的microRNA?92a及microRNA?92b分別用BCL2L11［61］和NLK［62］途徑促進腫瘤進展，而抑制它們的表達可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來阻止腫瘤進一步惡化.Fang等［63］報道，在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達上調(diào)的microRNA?93可以增強腫瘤細胞的生存能力，從而促進腫瘤進一步惡化.Qian等［64］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達的 microRNA?1224?5p具有很強的抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及擴散的作用.另外，在腦膠質(zhì)瘤表達上調(diào)的microRNA?125b、microRNA?155、microRNA?221／222、microRNA?330、microRNA?335等中也發(fā)現(xiàn)與腦膠質(zhì)瘤的進展有關(guān).

除了表達上調(diào)的 microRNAs，表達下調(diào)的microRNAs也與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān).研究［65］發(fā)現(xiàn)，microRNA?34a能通過抑制靶向目標(biāo) c?Met及Notch，進而抑制腦膠質(zhì)瘤的生長，但在腦膠質(zhì)瘤細胞中，microRNA?34a呈低表達狀態(tài)，進而失去抑制腦腫瘤細胞生長的能力，從而引起腫瘤進一步進展.microRNA?135a具有通過調(diào)控 STAT6，SMAS5和BMPR2等基因來誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)細胞凋亡的能力，但它在腦膠質(zhì)母細胞瘤中表達過低，從而導(dǎo)致腫瘤進一步惡化.在腦膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)的microRNA?181家族如microRNA?181a、microRNA?181b等均具有抑制腦膠質(zhì)瘤細胞生長、降低腫瘤浸潤性及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力［66］.上調(diào)腦膠質(zhì)瘤細胞中microRNA?181a及microRNA?181b的表達可以明顯抑制腫瘤生長及浸潤，并促進腫瘤細胞凋亡［66］.在腦膠質(zhì)瘤細胞中明顯表達下調(diào)的microRNA?218能抑制腦膠質(zhì)瘤惡化，通過上調(diào)microRNA?218的表達可以顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的活力、增殖及轉(zhuǎn)移，同時還能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［67］.此外，microRNA?128、microRNA?7、microRNA?326等眾多microRNAs均被發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)，并參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展.

目前，手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合術(shù)后替莫唑胺化療及放療能夠改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后.但在行替莫唑胺化療時，僅有一小部分患者受益.因為O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6?methylguanine?DNA methyl?transferase，MGMT）能迅速修復(fù)由烷化劑藥物（如替莫唑胺）引起DNA烷基化損傷的蛋白，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的化療耐藥性，從而限制了替莫唑胺的廣泛應(yīng)用［55］.隨著對microRNAs的深入探索，研究發(fā)現(xiàn)mi?croRNAs與腦膠質(zhì)瘤的進展與放化療的療效密切相關(guān).研究發(fā)現(xiàn)，microRNA?181b可作為一種生物標(biāo)記物來辨別哪個患者對替莫唑胺最敏感［55］.而MGMT是microRNA?181b的一個靶目標(biāo)，因為表達上調(diào)的microRNA?181b可以降低MGMT的表達水平，從而提高替莫唑胺的治療效果［68］.雖然表達上調(diào)的microR?NA?181b可以提高患者對替莫唑胺的化療敏感性，但表達上調(diào)的microRNA?21卻能夠降低患者對替莫唑胺的敏感性.作為腦膠質(zhì)母細胞瘤中最常見且表達上調(diào)的microRNA，microRNA?21具有使U87MG腦膠質(zhì)母細胞瘤的細胞逃避替莫唑胺介導(dǎo)的細胞凋亡的功能，而抑制 D54MG腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中microRNA?21的表達可以提高替莫唑胺的化療敏感性［69］.另外，Qian等［70］采用microRNA?21拮抗劑聯(lián)合替莫唑胺療法治療U87?MG和U251腦膠質(zhì)瘤細胞系，結(jié)果顯示此種療法具有明顯的抗腫瘤細胞增生及促進腫瘤細胞凋亡的作用.這些研究表明，microR?NA?21可以作為預(yù)測或監(jiān)測腦膠質(zhì)母細胞瘤患者對替莫唑胺抵抗的生物標(biāo)記物，從而制定出最佳的治療策略來改善患者預(yù)后.Tang等［71］研究結(jié)果顯示，由3個microRNA基因組成的microRNA?183／96／182簇能通過ROS?介導(dǎo)的凋亡途徑來調(diào)控替莫唑胺在腦膠質(zhì)瘤細胞中的抗腫瘤效果.此外，Yang等［72］在探討microRNA?136在腦膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)，下調(diào)microRNA?136的表達可以提高化療藥物介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡.研究［73］還發(fā)現(xiàn)，相較于替莫唑胺化療敏感的U251腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系，對替莫唑胺化療抵抗的U251R腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中 microRNA?195、microRNA?455?3p、microRNA?10a的表達明顯升高，替莫唑胺化療聯(lián)合拮抗 microRNA?455?3p、microRNA?10a或下調(diào)microRNA?195表達的療法具有強大的細胞殺傷能力.

microRNA?21作為第一個發(fā)現(xiàn)與腦膠質(zhì)瘤有關(guān)的microRNAs，其表達水平在放療敏感性中也起著重要作用.在一些腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系包括U87MG和U373的分析中發(fā)現(xiàn)，放療敏感性與microRNA?21的表達水平有關(guān)［74］.在放療抵抗的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中進行拮抗microRNA?21方式，可以提高此類細胞對放療的敏感性［74］.Li等［75］利用U251腦膠質(zhì)瘤細胞系研究microRNA?21聯(lián)合放療治療腦膠質(zhì)瘤的效果，結(jié)果顯示，microRNA?21拮抗劑可以通過上調(diào)Cdc25A蛋白的表達來提高U251腦膠質(zhì)母細胞瘤的放療敏感性，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡.Ng等［76］研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡的microRNA?100在放療抵抗的人腦膠質(zhì)瘤M059K細胞中的表達上調(diào)可以抑制ATM基因的表達，從而提高腦膠質(zhì)瘤細胞對放療的敏感性.Lee等［77］發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)母細胞瘤中過表達 microRNA?7可以提高放療殺傷腫瘤細胞的能力.

目前雖然有關(guān)micro?RNAs與腦膠質(zhì)瘤關(guān)系的研究取得了一定的成果，但有關(guān) micro?RNAs治療腦膠質(zhì)瘤的研究大多尚處于臨床前研究階段，有關(guān)microRNAs治療腦膠質(zhì)瘤的臨床研究結(jié)果尚未見報道.我們期待microRNAs治療腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)臨床試驗研究報道，從而為改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后或徹底治愈腦膠質(zhì)瘤帶來曙光.

2.6 抗血管生成的基因治療同其它類型的腫瘤一樣，腦膠質(zhì)瘤的快速生長常常引起腫瘤內(nèi)呈低氧狀態(tài)［78］，而腫瘤細胞在低氧狀態(tài)下能夠釋放如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、基質(zhì)金屬蛋白（matrix metalloproteinases，MMMPs）、血小板源生長因子 （platelet?derived growth factor，PDGF）等血管活性因子，誘導(dǎo)血管生成，從而為腫瘤提供足夠的血運，促進腫瘤的進展.基于這個發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外學(xué)者提出，可以通過干擾血管活性因子的釋放抑制腫瘤內(nèi)血管的生成發(fā)揮抗腫瘤作用.

研究［79］發(fā)現(xiàn)，VEGF是促進腫瘤內(nèi)血管生成最主要、最強的活性因子.Vredenburgh等［80］研究結(jié)果提示，VEGF拮抗劑貝伐單抗聯(lián)合化療藥物可增強腦膠質(zhì)瘤患者的放射治療效果.另一項利用VEGF拮抗劑貝伐單抗治療31例復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者的Ⅱ期試驗結(jié)果顯示，43%的腦膠質(zhì)瘤患者可部分緩解，中位總體生存期為1年［81］.除VEGF拮抗劑在腦膠質(zhì)瘤的治療方面發(fā)揮著重要的作用外，MMPs作為腫瘤血管生成的重要因子，有關(guān)其抑制腦膠質(zhì)瘤血管生成的研究也在同步進行.雖然目前大多數(shù)作用于MMPs的藥物（如普林司他、巴馬司他等）均因為臨床試驗失敗或存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)而停止研發(fā)，但對于MMPs藥物的研究仍然在進行.Nakabayashi等［82］采用第3代MMPs抑制劑MMI?166開展動物實驗研究，結(jié)果顯示MMI?166通過抑制MMP?2、MMP?9的表達抑制腦膠質(zhì)瘤細胞釋放的血管活性因子介導(dǎo)的血管生成.MMI?166在抑制腦膠質(zhì)瘤侵襲及血管生成方面發(fā)揮著極大的作用，為臨床使用MMPs拮抗劑治療腦膠質(zhì)瘤提供了一個新的選擇.另外，MMPs的非特異性抑制劑多西環(huán)素、作用于PDGF的藥物伊馬替尼及索拉菲尼等抗血管活性因子制劑也起著抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的血管生成、侵襲、進展的作用.抗血管生成因子的一系列研究可以為腦膠質(zhì)瘤的治療提供全新的手段，但目前大多數(shù)研究尚處于實驗階段，我們期待對此方法進行更深入的研究，為腦膠質(zhì)瘤患者帶來新的曙光.

3 結(jié)語與展望

雖然目前有關(guān)基因治療腦膠質(zhì)瘤的方法已有了初步成果，但目前所進行的研究試驗大多仍屬探索性研究，且大部分用于臨床試驗后并未達到預(yù)期的效果，因此，如何提高基因治療的臨床應(yīng)用效果及開發(fā)更高效的基因治療方法是今后研究的重點.我們期待基因治療的不斷創(chuàng)新，從而為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供更加科學(xué)和實用的策略.

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Advances in gene therapy of glioma

ZHENG Yun?Gui1，LU Xiao?Wen1，XU Lie?Peng1，LI Qin?Xi1，TU Yan?Yang2，YUAN Jun1
1Department of Neurosurgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Medical College， Shantou University， Shantou 515041， China；2Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710038，China

Glioma is the most common central nervous system neoplasm.It is characterized by infiltrating growth，high degree of malignancy，strong infiltration and poor prognosis.Despite of recent advances in surgery，chemotherapy and radiotherapy，prog?noses of glioma are rather poor.As a novel and promising therapy，gene therapy has been applied pre?clinically for the treatment of glioma in the last two decades.The strategies of gene therapy include suicide gene therapy，immune gene therapy，oncolytic viral therapy，tumor suppressor gene therapy，anti?angiogenic gene therapy and microRNAs mediated gene therapy.Here，these gene therapy approaches for the treatment of glioma are reviewed.

glioma；gene therapy；clinical trial

R739.41

A

2095?6894（2017）07?68?09

2017－04－17；接受日期：2017－05－03

廣東省科技計劃項目（2016ZC0167）

鄭云貴.碩士生.研究方向：腦血管病、腦腫瘤.E?mail：346812427＠qq.com

袁 軍.博士，副主任醫(yī)師，副教授.研究方向：腦血管病、腦腫瘤.E?mail：yjun116＠163.com