王菁

阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因動物模型及中藥組分治療研究進展

王菁

阿爾茨海默??；轉(zhuǎn)基因；動物模型；中藥組分

阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease，AD）是一種以進行性記憶減退、認知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病，已成為老年人群中繼心血管病、腫瘤和腦卒中之后的第四大死亡因素[1]。目前全世界AD患者高達3600萬，至2030年將有6570萬患者，全球用于AD的醫(yī)療費用超過6040億美元[2]。AD臨床表現(xiàn)記憶力和思維能力減退，發(fā)展為語言表達困難、喪失生活自理能力，最終死于感染等嚴重并發(fā)癥。AD主要病理特征為細胞外以β-淀粉樣蛋白（betaamyloid，Aβ）沉積為核心形成的老年斑、細胞內(nèi)以過度磷酸化的tau蛋白為核心形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofib-rillary tangles，NFT）以及特定腦區(qū)中樞神經(jīng)元大量丟失[3]。

1 以Aβ為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型

現(xiàn)階段制備轉(zhuǎn)基因動物模型的思路主要以體現(xiàn)AD特征為導(dǎo)向，模擬AD病理特征制備轉(zhuǎn)基因小鼠成為研究AD的重要手段。以β-淀粉樣蛋白沉積為核心形成的老年斑是AD主要病理特征之一，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）在非淀粉樣蛋白水解途徑中，α-分泌酶催化APP不產(chǎn)生Aβ沉積，其催化裂解后的APPs片段和羧基端片段中均不含完整的Aβ，故該途徑不產(chǎn)生老年斑的沉積；在淀粉樣蛋白水解途徑中，β-分泌酶和γ-分泌酶分別催化APP產(chǎn)生Aβ沉積，β-分泌酶在Aβ氨基端的位置切斷APP，生成一段APPs和包含Aβ的羧基段片段，后者又被γ-分泌酶催化剪切，最終釋放出Aβ[4]。腦內(nèi)Aβ斑塊沉積導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死和周圍膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的過度活化，最終引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致認知功能障礙，最終發(fā)展成AD[5]。

大多數(shù)研究者主要使用家族性AD中APP和PSEN（早老蛋白）突變基因來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。PSEN突變基因與人類早期AD發(fā)展密切相關(guān)，但是僅表達人類PSEN1（早老蛋白1）或PSEN2（早老蛋白2）突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠并未出現(xiàn)Aβ斑塊沉積[6]。Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠是轉(zhuǎn)人類APP695基因小鼠，到5月齡時能檢測到Aβ沉積，隨著Aβ沉積逐漸增加，學(xué)習(xí)記憶能力損傷。與單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，表達人類PSEN1和APP突變基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠能更快形成Aβ斑塊沉積，同時還出現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認知功能減退[7]。其中β-分泌酶在內(nèi)穩(wěn)態(tài)神經(jīng)功能和催化APP產(chǎn)生Aβ中具有重要作用。相比僅APP轉(zhuǎn)基因小鼠，表達BACE1和APP的雙轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ形成速度更快和更多Aβ沉積[8]。

2 作用于β-淀粉樣蛋白的藥物

針對Aβ在AD發(fā)病機制中的重要地位，如何減少Aβ的產(chǎn)生成為治療AD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。與Aβ密切相關(guān)的分泌酶是至今AD藥物開發(fā)的關(guān)鍵靶點，一方面α-分泌酶催化可溶性βAPP產(chǎn)生，從而抑制Aβ的生成；另一方面通過抑制β-或γ-分泌酶則能減少Aβ沉積[4]。

2.1 β-分泌酶抑制劑β-分泌酶是催化Aβ產(chǎn)生的初始和控速步驟，在Aβ生成過程中起決定性作用。抑制β-分泌酶的活性能從上游控制Aβ生成，從而起到防治AD的作用[3]。β-分泌酶抑制劑作為AD治療藥物，需要滿足以下條件：具有較高的抑制活性，較強的特異性，良好的生物利用度，最關(guān)鍵的是能夠穿越血腦屏障，這也是研發(fā)中所面臨的最大挑戰(zhàn)[9]。

目前作用于β-分泌酶的中藥有效成分研究取得長足進步，其中研究最常見的人參皂苷Rg1能夠通過激活PPARγ活性，抑制β-分泌酶的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而下調(diào)β-分泌酶mRNA和蛋白的表達水平，最終減少Aβ生成[10]。李維組[11]發(fā)現(xiàn)黃芪總苷通過抑制APP表達，降低β-分泌酶分泌以及促進α-分泌酶釋放，進而抑制Aβ生成，最終改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。研究表明[12]，三七皂苷R1能夠通過雌激素受體通路來抑制β-分泌酶的表達，從而降低AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元中Aβ含量。體外試驗[13]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿黃酮和淫羊藿苷能顯著性抑制細胞中β-分泌酶活性，減少APP基因轉(zhuǎn)染和Aβ生成。Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃連素通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2途徑，下調(diào)β分泌酶表達，從而減少Aβ的產(chǎn)生。官杰等[15]研究復(fù)方還腦益聰方對APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ、β-分泌酶表達的影響，發(fā)現(xiàn)其通過減少β、γ-分泌酶以及APP表達，抑制Aβ產(chǎn)生來改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上所述，雖然中藥組分和天然產(chǎn)物作為β-分泌酶靶標的抑制劑取得了一定的成績，但還存在明顯的不足[9]。此外，天然產(chǎn)物的藥理作用機制復(fù)雜，對β-分泌酶的抑制作用研究僅停留于藥效學(xué)研究水平，具體作用機制還有待進一步研究。

2.2 γ-分泌酶抑制劑γ-分泌酶是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的多亞基整膜蛋白復(fù)合體，主要參與APP重要跨膜蛋白的切割和水解過程。研究表明，γ-分泌酶是由四個亞單元（PS、NCT、APH1和PEN2）組成的膜內(nèi)蛋白水解酶。其中，四個亞單位中PS在跨膜蛋白處理中發(fā)揮核心作用，是引起家族性AD的主要原因；NCT具有γ-分泌酶的底物結(jié)合位點，即γ-分泌酶的底物首先由NCT特異性結(jié)合。APH1和PEN2是γ-分泌酶裂解sAPPβ所必需的[16]。

γ-分泌酶抑制劑的設(shè)計原則為將γ-分泌酶作為天冬氨酸蛋白酶的特性以及底物APP的結(jié)構(gòu)特點為依據(jù)，主要為肽醛類、雙氟酮類、羥乙基類等人工合成化合物。研究[17]表明，γ-分泌酶抑制劑LY-411575化合物能使APP小鼠中海馬區(qū)Aβ水平降低，同時未發(fā)現(xiàn)Notch信號途徑異常，但遺憾的是具有很強的胃腸道副作用。目前，以γ-分泌酶為靶點的中藥單體研究已成為中醫(yī)藥防治AD的新途徑。研究[18]表明，淫羊藿苷能下調(diào)快速老化小鼠（SAMP8）海馬中PS1基因表達，可能是通過抑制γ-分泌酶活性進而起到治療AD的作用。何首烏中水溶性成分二苯乙烯苷能下調(diào)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)PS1表達和抑制γ-分泌酶活性，進而達到防治AD的作用[19]。體外研究[20]表明，海風(fēng)藤中五味子乙素能抑制M146L細胞中γ-分泌酶活性，從而降低Aβ1-42表達。姜黃素能夠改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示可能是通過減少海馬CA1區(qū)PS2陽性表達，抑制γ-分泌酶活性，降低Aβ表達水平[21]。以上中藥有效成分對γ-分泌酶均具有一定的干預(yù)作用，為AD治療和預(yù)防提供理論和實驗基礎(chǔ)，也將是今后的一個主要研究方向。

3 以tau蛋白磷酸化為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型

在構(gòu)建具有β-淀粉樣蛋白沉積病理特征的轉(zhuǎn)基因小鼠過程中發(fā)現(xiàn)，許多APP轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)AD病理學(xué)和行為學(xué)改變先于β-淀粉樣蛋白沉積。雖然這些轉(zhuǎn)基因小鼠中具有Aβ斑塊沉積和認知功能障礙，但是它們沒有解決另一個主要的AD病理特征—神經(jīng)原纖維纏結(jié)[22]。

tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常狀態(tài)下可促進微管蛋白形成微管，并維持細胞骨架的穩(wěn)定性和神經(jīng)元可塑性[22]。tau蛋白由位于17號染色體上的tau基因選擇性剪切表達。由于tau蛋白過度磷酸化形成NFT，導(dǎo)致細胞骨架穩(wěn)定性下降，相關(guān)的軸突運輸障礙以及相應(yīng)神經(jīng)元的活性降低。那么Aβ淀粉樣斑塊和NFT兩者之間存在怎么的關(guān)系？Aβ淀粉樣斑塊和NFT怎樣誘導(dǎo)AD發(fā)生？這些難題至今未解決。

為了闡明tau蛋白異常磷酸化在AD發(fā)病機制中的作用，試圖采用過表達野生型或人類突變tau基因來制備轉(zhuǎn)基因模型小鼠來尋找突破口。研究[23]發(fā)現(xiàn)G272V和P301S突變的tau基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因小鼠NFT的形成和嚴重的認知功能障礙。tau轉(zhuǎn)基因小鼠JNPL3，開始未出現(xiàn)Aβ淀粉樣斑塊和認知障礙，后期才出現(xiàn)神經(jīng)元丟失和NFT病理變化。為了模擬與AD相關(guān)的NFT病理改變，tau基因敲除小鼠與表達人基因組tau的小鼠雜交，最終表達人類而不是小鼠tau基因[24]。在制備轉(zhuǎn)基因動物模型時，未真正考慮到物種本身所攜帶的基因表達情況，導(dǎo)致有些轉(zhuǎn)基因動物模型未能表現(xiàn)理想的AD病理特征。

為了彌補單轉(zhuǎn)基因小鼠模型未能完全模擬Aβ斑塊和NFT的缺點，能同時表達人類APP、PSEN和tau基因的三轉(zhuǎn)基因小鼠模型被逐漸重視。Tanemura等[25]建立了APP、PSEN和tau基因的三轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能同時模擬出Aβ和tau病理特征，即生成具有神經(jīng)毒性的Aβ和磷酸化tau蛋白，進而形成老年斑和NFT。另外，三轉(zhuǎn)基因小鼠能夠模擬其他AD病理和行為學(xué)特征包括：膠質(zhì)增生、突觸損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙[26]。

4 作用于tau蛋白磷酸化的藥物

目前，tau蛋白磷酸化水平是體內(nèi)多種蛋白激酶的磷酸化和脫磷酸化之間平衡所致，因此以抑制蛋白激酶磷酸化活性或增強脫磷酸化酶活性為思路而開發(fā)的小分子抑制劑成為抗AD藥物研究的重要方向之一[27]。現(xiàn)階段研究最多的GSK-3β和CDK5是最有效的磷酸化tau蛋白激酶之一，與NFTs存在高度的共定位，酶活性與tau蛋白過度磷酸化成正相關(guān)，因此被認為是與AD密切相關(guān)的關(guān)鍵tau蛋白磷酸化激酶[28-29]。中藥成分黃連素作用于igAPP突變小鼠發(fā)現(xiàn)，其通過抑制GSK-3β活性，進一步通過AKT/ GSK-3β信號通路，減少β-CTF的生成，降低非可溶性Aβ的產(chǎn)生[30]。中藥成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷（CIG）能夠抑制tau蛋白磷酸化，促進神經(jīng)干細胞增殖和神經(jīng)元分化，對細胞和動物模型均能起到神經(jīng)保護作用[12]。

5 結(jié)語與展望

盡管最為廣泛使用的多轉(zhuǎn)基因動物模型能在遺傳學(xué)上模擬AD特征性病理學(xué)特征包括細胞外Aβ沉積和NFT等，但是還不能完全模擬出人類AD的所有特征。隨著轉(zhuǎn)基因模型研究的不斷進步，理想的轉(zhuǎn)基因模型將不斷出現(xiàn)，屆時將加快AD治療藥物篩選。

AD是一種由多致病因素所致疾病，依據(jù)“單一分子、單一靶標”的理論研究的藥物只能緩解AD病情而非治愈。近年來，隨著對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和多向藥理學(xué)的認識，研究者逐漸改變單靶點藥物治療的思路，開發(fā)能同時調(diào)控多個靶點的高效而安全的“多靶點導(dǎo)向的活性配體”，提供了更廣闊的AD藥物研發(fā)思路。

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（收稿：2016-09-09修回：2016-12-16）

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