朱武暉 王曼

線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細胞凋亡中的保護作用

朱武暉 王曼

目的 分析線粒體損傷拮抗劑在六價鉻［Cr(Ⅵ)］所致肝細胞凋亡中的保護作用。方法 通過肝細胞培養(yǎng)以及模型的制備獲得受試細胞, 分為空白對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組, 空白對照組：不采用Cr溶液處理傳代細胞, 靜置24 h。模型組：采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨處理24 h。低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別在4 μM Cr(Ⅵ)溶液處理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM 環(huán)孢霉素A (CsA)干預(yù)。每組試驗10次。監(jiān)測各組細胞存活率、三磷酸腺苷(ATP)、肝細胞凋亡率、Caspase-3活性、通透性轉(zhuǎn)運孔(PTP)開放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、總腺苷酸(TAN)、PTP的ATP/ADP。結(jié)果 五組間細胞存活率、ATP、肝細胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比較, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外, 其余指標從模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、空白對照組存在遞進關(guān)系, 高劑量組與低劑量組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細胞凋亡中發(fā)揮了保護作用。

鉻；肝細胞凋亡；線粒體損傷拮抗劑

國際癌癥研究所將鉻確認為人類致癌物, 其Cr(Ⅵ)是當前毒性最強、致癌性最強的鉻價態(tài), 在細胞凋亡啟動中發(fā)揮重要作用［1］。理論上線粒體損傷拮抗劑能夠拮抗Cr(Ⅵ)所致線粒體損傷作用［2,3］。本次研究采用細胞研究, 分析線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細胞凋亡中的保護作用。

1 材料與方法

1. 1 受試細胞 人胚肝細胞系L-02(L-02肝細胞), 來自上海中科院細胞培養(yǎng)中心。

1. 2 試劑與儀器 主要包括重鉻酸鉀(基準級, 含量99.99%以上), ATP, 新生牛血清, 二甲基亞砜, 細胞凋亡率監(jiān)測劑。肝細胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量檢測試劑, 包括ATP、AMP標準品, 四丁基溴化銨、硫酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸,為分析純。細胞DNA損傷監(jiān)測試劑, 正常熔點瓊脂糖等。儀器主要包括HH-CP-T型CO2培養(yǎng)箱, 101-1AB型電熱鼓風干燥箱, 恒溫水浴箱, 酸度計, 自動平衡離心機, DYY-Ⅲ型電泳儀, 倒置顯微鏡, 酶標儀, 反相高效液相色譜儀等。

1. 3 方法

1. 3. 1 肝細胞培養(yǎng)以及模型的制備 常規(guī)細胞培養(yǎng)法獲得L-02肝細胞, 10%新鮮牛血清培養(yǎng)RPMI-1640培養(yǎng)基, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔2～3 d采用0.2% EDTA的0.25%胰酶消化, 傳代1次。采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨處理L-02肝細胞24 h, 加入MTT, 培養(yǎng)板可見紫藍色結(jié)晶, 甲臜裂解液溶液,植被模型成功。

1. 3. 2 分組與試驗 空白對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組, 空白對照組：不采用Cr溶液處理傳代細胞, 靜置24 h。模型組：采用4 μM Cr(Ⅵ)單獨處理24 h。低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別在4 μM Cr(Ⅵ)溶液處理后, 采用0.5、1.0、1.5 μM CsA干預(yù)。每組試驗10次。

1. 4 觀察指標 監(jiān)測的主要內(nèi)容包括細胞存活率、ATP、肝細胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示, 服從正態(tài)分布兩兩組間比較采用t檢驗, 多組間比較采用F檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

空白對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞存活率分別為(0.6780±0.0120)%、(0.5560±0.0150)%、(0.5830±0.0360)%、(0.6110±0.0150)%、(0.6353±0.0340)%, ATP分別為(0.769±0.045)、(0.583±0.025)、(0.573±0.018)、(0.584±0.024)、(0.673±0.053), 肝細胞凋亡率分別為(2.275± 0.011)%、(22.535±0.963)%、(18.461±0.495)%、(17.563± 0.361)%、(14.762±0.438)%, Caspase-3活性分別為(0.436± 0.001)、(0.652±0.032)、(0.631±0.105)、(0.583±0.132)、(0.525± 0.112)×106U/mgpro, PTP開放度分別為(53.204±1.535)、(23.003± 1.433)、(25.634±3.296)、(29.571±4.613)、(35.681±4.312),膜電位水平PTP分別為(40.708±2.143)%、(67.536±0.725)%、(61.540±1.864)%、(55.572±1.209)%、(51.510±1.646)%, PTP的ATP分別為(7.733±0.083)、(2.126±0.028)、(3.170±0.143)、(4.574±0.104)、(5.546±0.086)μg/106cells, ADP分別為(2.127± 0.125)、(0.635±0.043)、(0.725±0.356)、(0.956±0.056)、(1.478± 0.074)μg/106cells, AMP分別為(0.745±0.065)、(0.637±0.026)、(0.674±0.044)、(0.695±0.032)、(0.710±0.048)μg/106cells, TAN分別為(10.576±0.157)、(3.345±0.054)、(3.574±0.086)、(5.466±0.115)、(7.673±0.125)μg/106cells, PTP的ATP/ADP分別為(3.636±0.462)、(3.348±0.325)、(4.372±0.304)、(4.785± 0.298)、(3.752±0.431)。五組間細胞存活率、ATP、肝細胞凋亡率、Caspase-3活性、PTP開放度、膜電位水平PTP、PTP的ATP、ADP、AMP、TAN、PTP的ATP/ADP比較, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 除ATP、PTP的ATP/ADP外,其余指標從模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、空白對照組存在遞進關(guān)系, 高劑量組與低劑量組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 小結(jié)

從本次研究來看, Cr(Ⅵ)確實可能加速肝細胞凋亡, 這可能與其細胞的膜電位水平、PTP開放等作用的調(diào)節(jié)作用有關(guān)［4］。本次低劑量組、中劑量組、高劑量組采用CsA處理后,對象的各項指標更趨近于空白對照組, 各組之間存在遞進關(guān)系, 提示使用CsA能夠?qū)笴r(Ⅵ)引起的生物化學改變, 從而減輕肝細胞損傷［5,6］。CsA主要通過保護肝細胞線粒體膜完整性, 維持粒細胞功能等作用, 從而抑制Cr(Ⅵ)誘導肝細胞凋亡［7,8］。

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Protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by Cr (VI)

ZHU Wu-hui, WANG Man. Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Third People's Hospital, Qingdao 266041, China

Objective To analyze the protective effects of mitochondrial damage antagonists on hepatocellular apoptosis induced by hexavalent chromium ［Cr (Ⅵ)］. Methods The cells were obtained by hepatocyte culture and preparation of the model, and they were divided into blank control group, model group, low-dose group, middle-dose group and high-dose group. The blank control group

no performance of Cr solution for passage cells, and remained for 24 h. The model group received 4 μM Cr (Ⅵ) alone for 24 h. low-dose group, middle-dose group and high-dose group respectively received 0.5, 1.0 and 1.5 μM cyclosporine A(CsA) intervention after process of 4μM Cr (Ⅵ) solution. Each group was tested for 10 times. Monitoring were made on cell survival rate, adenosine triphosphate (ATP), liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, permeability transition pore (PTP) opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, adenosine diphosphate of PTP (ADP), adenosine monophosphate (AMP), total adenylate (TAN), ATP/ADP of PTP in groups. Results There were statistically significant difference in cell survival rate, ATP, liver cell apoptosis rate, Caspase-3 activity, PTP opening degree, the level of membrane potential PTP, ATP of PTP, ADP, AMP, TAN and ATP/ADP of PTP (P＜0.05). In addition to ATP, ATP / ADP, the remaining indicators had progressive relationship from the model-group, low-dose group, middle-dose group, high-dose group, blank control group, and there was statistically significant between high-dose group and low-dose group. Conclusion Mitochondrial damage antagonists shows protective effect on hepatocellular apoptosis induced by Cr (Ⅵ).

Chromium; Hepatocellular apoptosis; Mitochondrial damage antagonists

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.15.112

2017-05-12］

266041 青島市第三人民醫(yī)院肝膽外科