邵宜 鐘殿勝

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的80%[1].大多數(shù)NSCLC在診斷時即處于進展期,對于具有敏感突變基因的患者來說,靶向治療為其標準治療.多項研究[2,3]證實具有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)敏感突變的患者對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)具有良好反應,總反應率為55%-80%,無進展生存期(progression-free survival,PFS)為9個月-14個月.但是,即使具有相同類型乃至相同亞型,不同患者對TKIs的反應也不一致.因此,預測患者從TKIs治療中的獲益程度具有重要意義.

之前研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織的分子異常存在異質(zhì)性,即同一腫瘤中同時含有EGFR突變和野生型克隆[4],因此推測突變分子含量的不同是TKIs反應不一的部分原因,具有更高EGFR突變"豐度"的腫瘤患者可能從TKIs中獲益更多,僅僅定性分析突變來指導靶向治療已不能滿足臨床需求.隨著數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)、二代測序(next generation sequencing, NGS)等方法的出現(xiàn),定量檢測EGFR突變已經(jīng)成為可能.但是,EGFR突變豐度尚無統(tǒng)一定義,其與突變型肺癌及TKIs療效的關(guān)系也并無定論.本文將目前EGFR突變豐度的含義及其臨床意義綜述如下.

1 EGFR突變豐度的定義及檢測方法

豐度(abundance)概念來自于化學,最初指元素的相對含量.而腫瘤學中所謂EGFR基因突變的分子豐度還沒有統(tǒng)一的定義和標準,一般指突變型EGFR突變基因相對或絕對定量值,豐度的概念也隨檢測方法和檢測樣本的不同而各有不同.

1.1 EGFR突變豐度的半定量檢測 早期的研究根據(jù)突變檢測方法敏感性的不同來定義豐度.一般來說,EGFR突變頻率需達到20%-30%才能由直接測序發(fā)現(xiàn),而擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplif i cation refractory mutation system, ARMS)可檢測到1%的突變[5].根據(jù)二者敏感性的差別,2010年Zhou等[6]使用直接DNA測序和ARMS法檢測100例肺癌樣本,將兩種方法都為陽性者定義為EGFR突變高豐度,ARMS法陽性、測序陰性為低豐度,兩種方法都為陰性者為野生型,并發(fā)現(xiàn)高低豐度者對TKIs反應確有不同.此研究雖然具有重要的臨床意義,但僅用兩種方法的敏感性差異來判斷突變豐度較為粗糙,本質(zhì)上仍屬于半定量方法.此外,盡管研究要求樣本的腫瘤細胞比例>50%,但一定比例的正常細胞仍有可能干擾檢測結(jié)果,特別是對直接測序的影響較大.之后同樣有研究使用類似方法重復了此研究,但并未發(fā)現(xiàn)此種豐度和TKI反應之間具有相關(guān)性[7].

1.2 EGFR突變豐度的定量檢測 隨著突變定量檢測方法的出現(xiàn),更多研究使用EGFR突變和野生型拷貝的比值來定義豐度.2009年,Yung等[8]第一次使用豐度概念并用dPCR將EGFR突變定量化.研究使用微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)方法來定量NSCLC患者血漿和腫瘤組織的EGFR常見突變(19外顯子缺失和L858R點突變).ddPCR敏感性高,可檢測到臨床樣本的單個突變DNA分子,并準確測定突變及野生序列的數(shù)量.作者發(fā)現(xiàn)檢測到的比例濃度可低至0.1%,并將豐度定義為突變分子數(shù)在總的DNA中所占濃度.研究發(fā)現(xiàn)突變患者接受TKI治療后出現(xiàn)EGFR突變豐度的下降,但沒有分析基線突變豐度和療效預測及預后價值.

Wang等[9]使用納流控dPCR分析平臺(nanofluidic digital PCR assay platform),通過計算EGFR分子和單拷貝基因RPP30數(shù)量的比值來確定基因組DNA拷貝中含有多少突變分子,也即EGFR基因拷貝的相對數(shù).此種方法檢測下限可低至0.02%,檢測到20個手術(shù)切除樣本的EGFR突變豐度為0.02%-9.26%.

Marchetti等[10]使用半定量指數(shù)(semiquantitative index, SQI)定量EGFR突變.SQI來自包含突變EGFR和固定量野生型EGFR的已知拷貝數(shù)稀釋系列,并以qPCR中野生型DNA做為內(nèi)參,反映EGFR突變基因?qū)Ρ纫吧涂截悢?shù)的趨勢.研究檢測了69例EGFR突變腫瘤和21例陰性對照患者的血漿,發(fā)現(xiàn)SQI和厄洛替尼治療后反應相關(guān).

Yang等[11]的研究使用ddPCR方法定量和動態(tài)檢測循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)的EGFR突變,發(fā)現(xiàn)ddPCR檢測的下限是0.04%.以腫瘤組織的EGFR突變?yōu)榻饦藴?血漿ctDNA的一致率為74%(54/73).ddPCR檢測循環(huán)EGFR突變等位基因和野生型等位基因的絕對量,突變EGFR ctDNA和野生型ctDNA的濃度比值定義為EGFR突變豐度.其中,54例未治療突變患者血漿中中位絕對和相對EGFR突變等位基因量是487拷貝/反應和5.15%,因此,研究將相對EGFR突變量>5.15%者定義為高豐度(n=27),而≤5.15%者為低豐度(n=27).

關(guān)于厄洛替尼和化療間插治療的FASTACT-2研究[12]前瞻性用Cobas檢測基線、第3周期和疾病進展(progressive disease, PD)的血液標本,檢測血漿游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)EGFR突變狀態(tài),并使用突變拷貝數(shù)/血漿毫升數(shù)定量監(jiān)測TKIs治療過程中動態(tài)變化.但此豐度定義方法可能容易受到非腫瘤DNA數(shù)量等影響,是否準確還需要進一步驗證.

NGS同樣可用來檢測突變豐度.2016年,Zhang等[13]使用單分子擴增和再測序技術(shù)(single-molecule amplif i cation and resequencing technology, SMART)行基因檢測,將突變率定義為突變等位基因數(shù)量/總等位基因數(shù)量.以ARMS做為標準,SMART的敏感性和特異性分別是98.7%和99.0%.但研究并未發(fā)現(xiàn)豐度和使用TKIs的PFS之間具有相關(guān)性.

由于對一代TKIs耐藥機制的深入理解和三代TKIs的出現(xiàn),T790M定量檢測的重要性也逐漸被認識到.有研究[14]將T790M等位基因數(shù)量對比活化突變等位基因數(shù)量進行T790M相對定量,使用磁珠乳液擴增PCR(bead,emulsion, amplif i cation, magnetic, BEAMing)檢測23例TKIs后PD患者和21例突變未經(jīng)治患者的ctDNA,發(fā)現(xiàn)T790M比活化突變值為13.3%-94.0%.檢出率在PD患者中更高,兩組分別是82.6%和61.9%(P=0.18).還有研究使用相同定量方法檢測T790M及活化突變在TKIs治療前后變化[15],使用dPCR檢測TKIs治療前后腫瘤組織.三代TKIs藥物rociletinib的I期/II期研究對PD患者進行活檢,同樣檢測T790M對活化突變等位基因的相對頻率[16].

有研究使用dPCR檢測cfDNA EGFR T790M,以突變T790M/(突變T790M+野生型等位基因)比值進行定量,并以5%和0為界進行高/低/無分組,研究其基線值和TKIs反應關(guān)系,及動態(tài)變化和療效關(guān)系[17].同樣地,上文[13]提到的SMART技術(shù)也可定量檢測T790突變,將突變率定義為突變等位基因數(shù)量/總等位基因數(shù)量,用ARMS和SMART測得T790M突變率分別是1.1%和2.2%.三代TKI奧希替尼的臨床研究同樣使用NGS來檢測T790M豐度和療效的相關(guān)性[18].

1.3 蛋白檢測 由于DNA測序的敏感性依賴于腫瘤細胞在樣本中的比例,特別是依賴于攜帶突變的腫瘤細胞百分比.因此,有研究[19]發(fā)現(xiàn)針對兩個最常見EGFR突變的特異性兔單克隆抗體,用Western blot、免疫熒光、免疫組化(immunohistochemistry, IHC)檢測340例NSCLC患者的組織突變,和直接及以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的DNA測序方法相比,敏感性為92%,特異性為99%.不同于DNA測序,IHC的結(jié)果依賴于單個腫瘤細胞染色的強度,而不是整個腫瘤裂解物.因此,腫瘤樣本突變?nèi)绻械桶俜直鹊腅GFR突變腫瘤細胞,DNA測序可能難以測出,但能被IHC突變特異性抗體檢測到,尤其是在小樣本標本具有優(yōu)勢.此外,IHC也較少受到癌細胞空間分布的影響.但抗體只針對EGFR的特定常見突變,其他突變無法測出.

之后有研究[20]使用IHC定量檢測47例PCR證實突變的NSCLC患者,表達分數(shù)由染色強度和表達突變EGFR腫瘤組織的比例共同決定.表達EGFR突變的腫瘤細胞比例(比例分數(shù)):0:無;1分:1%-10%;2分:11%-30%;3分:31%-50%;4分:51%-70%;5分:71%-100%.染色強度(強度分數(shù)):>10%的腫瘤細胞中,0:不染色;1分:弱染色;2分:中度染色;3分:強染色.總表達分數(shù)為二者相加.19外顯子缺失和L858R突變的中位分數(shù)分別是4分和7分,因此將19外顯子缺失定量為:0分-3分:低表達,4分-8分:高表達;L858R定量為:0分-6分:低表達,7分-8分:高表達.

2 EGFR突變豐度的臨床意義

2.1 反映腫瘤異質(zhì)性 有研究[21]使用qPCR檢測突變比.如上文定量方法所述,突變比=突變水平/(突變水平+野生等位基因水平).檢測50例NSCLC患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶,原發(fā)灶不同部位的定量平均突變偏差是18.3%(范圍0-54.3%),具有高水平一致性.而轉(zhuǎn)移灶腫瘤EGFR突變比顯著低于原發(fā)灶,Kappa值是0.615(P<0.01),這一研究說明盡管為同一來源腫瘤,原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的突變豐度也具有異質(zhì)性,也可以解釋在TKIs治療過程中,不同病灶反應不一.

2.2 突變豐度與疾病轉(zhuǎn)歸 Yung的研究中[8],突變序列的血漿濃度和臨床反應一致性良好.所有部分緩解(partial remission, PR)和完全緩解(complete remission, CR)的患者濃度降低,而PD患者突變持續(xù).其中一個患者初始反應后因藥物不良反應停用TKI,停藥后4周腫瘤相關(guān)EGFR突變再次出現(xiàn),證明EGFR豐度變化可反映疾病動態(tài)變化,但研究未闡述基線豐度水平和療效之間的關(guān)系.

TKIs治療過程中血漿EGFR突變動態(tài)定量改變和臨床結(jié)局的關(guān)系還不清楚.III期隨機對照研究CTONG0901[22]探索性分析了血漿EGFR L858R突變和TKIs反應及耐藥的關(guān)系.使用qPCR檢測80例患者血漿的相對L858R拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)在對TKI反應最好時L858R量最低.和基礎(chǔ)L858R量相比,進展時量增加超過一倍作為分界,61例患者進展時L858R增長到最高水平(上升型),19例患者進展時穩(wěn)定不變(穩(wěn)定型),上升型的PFS長于穩(wěn)定性,兩組的中位PFS分別是11.1個月和7.5個月.但此種方法為回溯性分析,缺乏療效預測價值.

2.3 突變豐度預測TKIs療效 初治患者的基線EGFR豐度似可預測TKIs療效.Zhou等[6]的半定量豐度研究中,100個月接受檢測的患者中51個月為高豐度,18個月為低豐度,接受吉非替尼治療后,PFS分別是11.3個月和6.9個月(P=0.014),說明基線的相對EGFR突變豐度可以預測TKI獲益程度.但Chiu等[7]發(fā)現(xiàn)高低豐度患者對TKI反應沒有顯著不同,直接測序和ARMS法檢測突變結(jié)果不同和相同患者的PFS分別是13.4和 10.9個月,沒有顯著統(tǒng)計學差異.但Zhou的研究和Chiu的研究不同之處在于,前者只納入腫瘤細胞超過50%的樣本,而后者大約60%的標本腫瘤細胞小于50%,不能除外腫瘤細胞比例對直接測序突變檢測的影響.

吉非替尼治療患者使用IHC進行EGFR突變定量,高分比低分的PFS顯著延長,分別是12.2個月和3.4個月(P<0.001),證實腫瘤組織EGFR突變表達的定量分析可預測TKIs療效.

同樣,豐度動態(tài)變化也可反映TKIs療效.血漿EGFR突變快速降低預示更好的TKIs反應[10].FASTACT-2研究,EGFR突變特異性cfDNA水平在第3周期降低,進展時升高.第3周期時血漿EGFR突變依舊陽性預示較差的臨床結(jié)局[12].

Yang[11]的研究發(fā)現(xiàn),同為腫瘤組織突變陽性患者,和血漿野生型(n=19)相比,ctDNA突變的患者(n=54)具有更好的PFS(12.6個月 vs 6.7個月,P<0.001)和OS(35.6個月 vs 23.8個月,P=0.028).和低EGFR豐度(≤5.15%)患者相比,高EGFR突變豐度患者(>5.15%)具有更好的PFS(15.4個月 vs 11.1個月,P=0.021).分析67例進展后患者血漿DNA,43.3%患者出現(xiàn)豐度降低,19.4%不變,37.3%升高.降低組具有更好的PFS(12.7個月 vs 7.1個月,P=0.001)和OS(28.3個月 vs 14.9個月,P=0.027).T790M的出現(xiàn)和豐度變化趨勢無關(guān).

FASTACT-2研究中[12],總的EGFR突變特異性cfDNA水平在第3周期降低,在PD時回歸.和化療+安慰劑組對比,在第3周期和PD時化療+厄洛替尼治療組突變EGFR等位基因數(shù)量更少(第3周期:5拷貝/mL vs 0;PD:83拷貝/mL vs 6拷貝/mL).厄洛替尼組第3周期仍可檢測到突變EGFR等位基因的患者PD風險增加62%,死亡風險增加55%,因此,第3周期時的cfDNA EGFR突變陽性是更差PFS和OS的預測因子.

另有研究[23]分析9例TKIs PD患者,所有患者接受厄洛替尼治療后都出現(xiàn)血漿EGFR突變豐度降低,其中8例患者達到血漿CR,1例沒有出現(xiàn)血漿CR的患者則出現(xiàn)了早期進展.6例患者在客觀進展時血漿中又檢測到了突變EGFR,血漿PD出現(xiàn)在在RECIST進展前4周-12周.

使用SQI半定量檢測血漿EGFR突變[10],TKIs治療后的4 d-60 d系列EGFR檢測出現(xiàn)進行性SQI下降.經(jīng)過TKIs4 d治療后,SQI平均降低13.5%,8 d降低41.6%,14 d降低63.5%.除了2例患者,在8 d-60 d后血漿檢測都為陰性.70%患者(快速反應者)在14 d時下降超過50%,另外30%的患者(緩慢反應者)在14 d時下降小于50%.2個月時SQI的降低率和腫瘤縮小比例(percentage of tumor shrinkage, PTS)顯著相關(guān),快速反應者PTS平均降低(59.1±1.8),緩慢反應者則降低(18.3±3.7)(P<0.000,1).2例慢反應者EGFR突變沒有完全清除,在35 d時T790M就意外出現(xiàn),之后進一步增長,這些病例被定義為早期耐藥.因此,連續(xù)檢測血漿基因型可能是反映靶向治療療效的良好臨床分子標志,也是潛在的早期臨床試驗終點.

有研究[24]探索了突變豐度和再使用TKIs的關(guān)系.檢測51例TKIs獲得性耐藥患者,使用qPCR檢測突變,EGFR突變豐度=突變EGFR量/(突變量+野生量).51例突變NSCLC患者的中位豐度是0.501,5,因此將豐度≥0.501,5高豐度(H),<0.501,5為低豐度(L).和L組相比(27/51),H組患者(24/51)再次使用一代TKIs具有顯著延長的PFS(5.27個月 vs 2.53個月,P=0.033).因此,使用一代TKIs耐藥后,具有更高突變EGFR豐度是接受TKIs再治療的潛在指標,可能是因為依賴于EGFR信號通路的腫瘤細胞比例更高.

2.4 T790M突變豐度的臨床意義 T790M突變豐度的增加可能和一代TKIs耐藥具有相關(guān)性.有研究[15]使用dPCR檢測到所有25個組織中T790M(治療前13個樣本,治療后12個樣本),計算活化突變(L858R)或T790M等位基因和對照等位基因數(shù)量比值.用藥前L858R/對照=65.62%,T790M/對照=0.34%,T790M等位基因和活化突變等位基因數(shù)量比(T/A)=0.52%.用藥后L858R/對照=3.87%,T790M/對照=1.89%,T/A=48.84%.10例低T/A比值,TKIs治療顯著腫瘤退縮.其中6例耐藥患者T/A出現(xiàn)顯著增加.因此,一代TKIs治療過程中,T790M豐度的增加可能提示出現(xiàn)獲得性耐藥.

但也有研究得出不同結(jié)論.有研究用dPCR檢測TKIs治療前后血漿cf-DNA T790M的變化[17],發(fā)現(xiàn)TKIs治療前T790M陽性患者具有更差的PFS(8.9個月vs 12.1個月,P=0.007)和OS(19.3個月 vs 31.9個月,P=0.001),而基線高豐度(>5%)T790M預示著更差的PFS(7.1個月vs 9.5個月,P=0.001).但在TKIs治療過程中,T790M數(shù)量增加者反而具有更優(yōu)PFS(11.6個月 vs 7.1個月,P=0.044)和OS(26.3個月 vs 19.3個月,P=0.015).是否天然和獲得性T790M的臨床意義不同還需要進一步探索.

治療前T790M陽性細胞比例可預示對T790M陽性腫瘤對三代TKIs rociletinib的治療反應.25例接受rociletinib治療的患者,基線T790M陽性細胞比例更高者,rociletinib治療后具有更大的腫瘤退縮,說明T790M負荷定量信息可提示患者治療反應,腫瘤中定量等位基因頻率是預測最大獲益的指標[15].同樣,奧希替尼的I期AURA研究的事后分析以相對等位基因比例(allelic fraction, AF),也即EGFR突變cfDNA和野生型EGFR cfDNA的比值進行突變定量,發(fā)現(xiàn)cfDNA T790M突變陽性患者,組織T790M陽性腫瘤(n=108)的AF值高于T790M陰性腫瘤(n=16)(相對T790M AF,33.6% vs 16.8%,P=0.004,7).相對T790M AF增加和最大反應深度并不總相關(guān)(R=-0.183),但和AF<10%患者相比,相對T790M AF>10%的患者具有更大的反應深度(P=0.040,7).但一項關(guān)于奧希替尼治療血檢T790M陽性患者的臨床試驗中[18],較小的T790M突變等位基因比例和更大的腫瘤退縮具有相關(guān)趨勢,反應最好的7例患者中(腫瘤退縮大于50%),3例T790M<0.25%,似乎提示任何豐度的T790M都可從三代TKIs中獲益.

T790M的動態(tài)變化可能和三代TKIs療效相關(guān).TIGER-X研究中[25],NGS檢測患者ctDNA T790M突變拷貝數(shù)的絕對值,發(fā)現(xiàn)三代TKIs rociletinib治療后,血檢EGFR突變水平下降可能可預測反應深度.檢測9例患者尿液,發(fā)現(xiàn)不論最佳確認反應為何,第1周期對比基線都出現(xiàn)尿T790M水平的顯著下降(范圍-51%到-100%;P=0.009,1).但是在2例PD患者,下降受阻(-51%和-70%),而PR或SD為最佳反應的患者下降范圍為-83%到-100%,反映了rociletinib可降低T790M陽性克隆增殖.

3 總結(jié)

dPCR、NGS等方法的出現(xiàn)使EGFR定量檢測成為可能.盡管臨床還沒有標準定義及檢測EGFR突變的方法,但EGFR突變豐度的檢測及其意義已經(jīng)日益引起人們的重視.不同病灶的不同豐度可以反映腫瘤異質(zhì)性,EGFR活化突變的基線豐度值可能和TKIs療效相關(guān),TKIs治療過程中EGFR豐度的變化對于檢測療效、早期發(fā)現(xiàn)進展等具有重要意義.T790M耐藥突變豐度的增加可能可早于臨床提示一代TKIs獲得性耐藥,其變化也是三代TKIs療效的良好預測因子.總之,EGFR突變豐度檢測具有十分重要的臨床意義.

但是當前對突變豐度的應用還存在明顯不足.豐度概念混雜,沒有統(tǒng)一標準,各種檢測方法缺乏絕對可比性.另外,突變拷貝數(shù)的檢測在一定程度上受到各種標本所含腫瘤細胞的比例不同的影響,而且很多EGFR突變肺癌合并存在EGFR基因擴增,豐度檢測是否需要進行腫瘤細胞比例和基因擴增的校正還需要更多的探索.