李維 劉旭 張國倩 張琳琳

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,無論其發(fā)病率還是死亡率均居惡性腫瘤之首,已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命健康的常見疾病.非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的一種,其患者數(shù)量為肺癌患者總數(shù)的80%以上[1].目前NSCLC的治療措施主要有手術(shù)、放療、化療及生物治療等,早期手術(shù)可以治愈NSCLC,但大部分NSCLC患者確診時已屬晚期,目前尚無治愈的根本療法.研究[2]表明,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及Notch信號通路,對腫瘤的形成和發(fā)展具有重要作用.Notch信號通路高度保守,由Notch受體、Notch配體、CSL DNA結(jié)合蛋白(CBF-1, suppressor of hairless, Lag)、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成.當(dāng)相鄰細(xì)胞的Notch受體、配體相互接觸時,γ-分泌酶催化裂解形成Notch胞內(nèi)段,之后Notch胞內(nèi)段進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jk,調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子超級組成員Hes和Hey分子的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖、凋亡等過程.Notch通路還與其他信號通路存在交叉調(diào)控,從而擴(kuò)大其生物調(diào)節(jié)作用[3].目前已有不少研究Notch通路與肺癌的關(guān)系[4,5],可是尚未形成一個明確的結(jié)論,而Notch通路生物學(xué)作用下的具體的機(jī)制更是十分缺乏,仍然有待進(jìn)一步研究.

近幾年來,中藥活性成分的抑癌作用得到了廣泛關(guān)注,在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的作用具有重要意義.綠原酸(chlorogenic acid, CGA)由奎尼酸(quinic acid, QA)與反式肉桂酸(trans cinnamic acidst-CA)縮合而成的酯類化合物家族,是多種中草藥中的一種活性成分,具有抗炎作用、抗病毒作用、降血脂和血糖作用、抗氧化作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等諸多生物學(xué)活性.已有研究[6]證明,綠原酸具有抑制肺癌細(xì)胞增值和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用.本研究建立了NSCLC細(xì)胞裸鼠模型,通過檢測Notch信號通路及相互作用信號通路的關(guān)鍵蛋白的表達(dá),進(jìn)一步闡明綠原酸通過Notch1信號通路調(diào)控NSCLC凋亡的作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 綠原酸(250 mg, >98%)購自Sigma-Aldrich公司(溶解于1640培養(yǎng)基,0.22 μm濾膜過濾),胎牛血清購自上海滬峰化工有限公司,RPMI-1640培養(yǎng)液購自上海博麥德生物技術(shù)有限公司,胰蛋白酶購自GIBCO公司,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所,TRizol購自北京百奧森泰生物科技有限公司,總蛋白提取試劑盒購自Sigma-Aldrich公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mix、DNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司,PTEN抗體(兔抗)、p-PTEN抗體(p-Ser370,兔抗)、p-Akt(p-Ser473,兔抗)抗體購自Santa Cruz公司,Notch1抗體(兔抗)、GAPDH抗體(兔抗)、HRP-二抗(羊抗兔)等相關(guān)抗體購自Exapha Biologicals公司,其他試劑購自北京鼎國昌盛生物試劑公司.引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成.

1.2 主要設(shè)備 多功能酶標(biāo)儀(Wallac公司);TS-100倒置相差顯微鏡購自日本 Nikon公司;Real-time PCR儀購自BIO-RAD公司,二氧化碳培養(yǎng)箱(RCO3000TVBA)購自美國 REVCO公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用裸鼠BALB/c-nu由北京華阜康生物科技有限公司提供許可證號:[SCXK(京)2014-0004],均為4周齡的健康SPF級雄性小鼠,體重為(18.77±1.02)g,裸鼠在無特定病原體條件下的層流架內(nèi)飼養(yǎng),無菌操作下定期更換籠具、墊料、飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC細(xì)胞株A549購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫,細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清RPMI-1640,其中含終濃度為100 μg/mL青霉素和鏈霉素,2 mmol/L的L-谷氨酰胺;將細(xì)胞置于37oC、5% CO2孵箱中培養(yǎng);2 d傳代一次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于96孔板中,每孔接種1X105個細(xì)胞;培養(yǎng)24 h之后,在培養(yǎng)基加入梯度濃度的綠原酸(終濃度為:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL),每個濃度設(shè)6個平行孔,綠原酸終濃度為0 μg/mL的為對照組;分別在藥物處理A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,每孔加入20 μL的5 mg/mL的MTT試劑,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸出,加入150 μL的DMSO試劑,充分震蕩后,用多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定吸光度.計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率.抑制率(%)=(1-藥物處理組OD值/對照組OD值)X100%.

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期分析 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度,2 mL/孔,每孔細(xì)胞數(shù)目大約為4X105個.24 h后加入系列濃度梯度的綠原酸培養(yǎng)基,使綠原酸的終濃度為:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL;常規(guī)培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞,用195 μL的Bind Buffier重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育10 min.離心去上清后,用190 μL的Bind Buffier重懸細(xì)胞,再加入10 μL碘化丙啶(100 mg/L),并與避光放置,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,并用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.另一組細(xì)胞采用梯度綠原酸處理細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞,PBS清洗后用預(yù)冷的95%乙醇處理,離心去上清后,碘化丙啶(100 mg/L)(含RNase 1 g/L)0.5 mL,室溫避光孵育30 min,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析.

1.7 建立裸鼠成瘤模型 大量培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞,將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),將2X106的腫瘤細(xì)胞種植于裸鼠皮下,共接種30只裸鼠,飼養(yǎng)觀察裸鼠成瘤情況.在接種2周-3周后,腫瘤大小約1 cm3時,選擇腫瘤大小接近的20只小鼠,根據(jù)隨機(jī)分層法分組,分為2組.實(shí)驗(yàn)組每天在腫瘤區(qū)域注射綠原酸溶液(100 μg/mL);對照組每天注射相同體積的生理鹽水;每次注射體積為100 μL.連續(xù)觀察并測量腫瘤的生長情況:每周測腫瘤長徑(L),短徑(W).腫瘤大小按公式V=1/2LW2計(jì)算.

給藥4周后處死裸鼠取瘤稱重,檢查肝臟肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移情況.每個腫瘤取兩部分,一部分用于提取瘤組織蛋白,另一部分提取組織RNA.

1.8 實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測mRNA相對含量 取100 mg左右腫瘤組織,加入1 mL TRIzol,用研缽研磨至無明顯肉眼可見固體.按照說明書操作步驟,提取RNA.然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟,將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA用SYBR Green染料結(jié)合法,進(jìn)行Real-time PCR.目的基因的相對表達(dá)量經(jīng)過內(nèi)參標(biāo)化后分析(表1).

1.9 免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達(dá) 取少量腫瘤組織,按照總蛋白提取試劑盒步驟,提取組織總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定(具體步驟見商品說明書).將蛋白液與蛋白上樣緩沖液混合后,100oC變性10 min,然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.電泳后,取下凝膠,標(biāo)記方向后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗(兔源Notch1、p-PTEN、PTEN、p-Akt抗體按照1:800濃度稀釋比稀釋,GAPDH抗體按照1:2,000濃度比稀釋),孵育二抗(羊抗兔二抗按照1:5,000濃度稀釋比稀釋),最后經(jīng)過充分洗膜后,進(jìn)行曝光,分析結(jié)果.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,組間比較采用Student's t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對NSCLC A549細(xì)胞增殖的影響 綠原酸處理A549細(xì)胞48 h后,對照組細(xì)胞生長狀態(tài)較好;而給藥組細(xì)胞隨著綠原酸劑量的升高,細(xì)胞脫落懸浮,破碎增多,部分細(xì)胞呈凋亡狀態(tài).

在綠原酸處理A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,分別采用MTT法檢測細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果顯示,與對照組比較,綠原酸對A549細(xì)胞的抑制率明顯升高(P<0.05),并且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢.在100 μg/mL綠原酸作用在72 h時,抑制率達(dá)最高(61.63%)(表2).

2.2 綠原酸對NSCLC A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測綠原酸作用于A549細(xì)胞72 h后,隨著綠原酸濃度增加,G2期/M期細(xì)胞百分比逐漸增加,且均高于對照組,差異顯著(P<0.05或P<0.01);隨著給藥濃度增加,細(xì)胞的凋亡率逐漸增加,均高于對照組,差異顯著(P<0.05或P<0.01)(圖1,表3).

2.3 綠原酸對A549細(xì)胞裸鼠荷瘤模型腫瘤增殖的影響 通過A549細(xì)胞裸鼠荷瘤模型發(fā)現(xiàn),綠原酸能夠抑制裸鼠腫瘤的生長增殖,實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤大小明顯小于對照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見表4、圖2、圖3.將裸鼠處死后,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組裸鼠無轉(zhuǎn)移瘤出現(xiàn),而在對照組肺中發(fā)現(xiàn)有6例微小轉(zhuǎn)移瘤.實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量為(0.48±0.12)g,對照組為(0.83±0.22)g,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

2.4 綠原酸對Notch信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)量的影響 實(shí)驗(yàn)組Notch1的配體Delta4、VEGF的mRNA相對表達(dá)量明顯小于與對照組(P<0.05).實(shí)驗(yàn)組Notch1信號通路下游效應(yīng)分子HES1、HEY1的mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05).見圖4.

2.5 綠原酸對PTEN-PI3K/AKT通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響 檢測Notch1及PTEN-PI3K/AKT通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對照組比較,試驗(yàn)組Notch1蛋白表達(dá)明顯降低,且p-PTEN、PTEN蛋白表達(dá)量升高,總的PTEN蛋白表達(dá)量增多;試驗(yàn)組p-Akt的表達(dá)量減少.見圖5.

表 1 相關(guān)基因PCR引物Tab 1 Related gene PCR primers

表 2 綠原酸對A549細(xì)胞增殖的抑制作用(Mean±SD)Tab 2 Inhibitory effect of chlorogenic acid on proliferation of A549 cells (Mean±SD)

表 3 綠原酸對A549細(xì)胞周期分布時相的影響(Mean±SD)Tab 3 Effect of chlorogenic acid on the cell cycle profile of A549 cells (Mean±SD)

表 4 不同時間點(diǎn)裸鼠腫瘤大小的比較(Mean±SD, cm3)Tab 4 Comparison of tumor size in nude mice at different time points (Mean±SD, cm3)

3 討論

綠原酸類物質(zhì)是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中,杜仲、金銀花、咖啡等植物中綠原酸類物質(zhì)含量較高.綠原酸類物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抑制細(xì)胞生長等途徑產(chǎn)生抗癌作用,對肺癌、乳腺癌、肝癌具有顯著的抑制作用,被認(rèn)為是癌癥的有效化學(xué)防護(hù)劑[6-8].但綠原酸對肺癌的抑制作用機(jī)制的研究并不多見.

Notch信號通路與人類許多腫瘤都存在密切的關(guān)系.Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用,Notch蛋白經(jīng)過三次剪切,由胞內(nèi)段釋放入胞質(zhì),激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因,發(fā)揮生物學(xué)作用.Notch信號通路不僅在組織器官的正常發(fā)育中起作用,還與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-13].有研究表明Notch信號通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[14],但是具體的作用機(jī)制一直沒有達(dá)成共識.本文通過研究Notch受體、配體以及相關(guān)因子在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞裸鼠荷瘤模型中的表達(dá),探討Notch1信號通路與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,闡明綠原酸抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的原理,同時為以Notch1信號通路為靶點(diǎn)的治療提供分子機(jī)制方面的理論支持.

本研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞及動物水平上,綠原酸能有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡.同時本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肺癌組織的Notch1 mRNA的平均表達(dá)水平顯著下降,同時下調(diào)下游的HES1和HEY1 mRNA的表達(dá),提示綠原酸可以通過Notch1信號通路轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控非小細(xì)胞肺癌凋亡的.有研究[15]發(fā)現(xiàn),抑制VEGF表達(dá)可以達(dá)到抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的血管生成的作用.VEGF可誘導(dǎo)Notch1配體Delta4表達(dá)增高,從而可啟動Notch信號傳導(dǎo)通路.研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路配體Delta4以及VEGF的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組減少Delta4以及VEGF的mRNA水平的表達(dá).因此,推測綠原酸可能是通過減少VEGF的表達(dá),下調(diào)Delta4水平,從而抑制Notch1信號通路的活化.

圖 1 綠原酸對A549細(xì)胞凋亡率的影響.實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01.Fig 1 Effect of chlorogenic acid on apoptosis rate of A549 cells. The experimental group compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.

圖 2 綠原酸對腫瘤生長增殖的影響Fig 2 Effect of chlorogenic acid on tumor growth and proliferation

圖 3 兩組裸鼠腫瘤比較Fig 3 Comparison of nude mice tumers of two groups

圖 4 Real-time PCR檢測Delta4、VEGF、Notch1、HES1、HEY1的mRNA表達(dá)水平.實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,**P<0.01,*P<0.05.Fig 4 mRNA expression of Delta4, VEGF, Notch1, HES1,HEY1 detected by Real-time PCR. The experimental group compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01.

圖 5 Western blot檢測Notch1、PTEN、p-PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)水平Fig 5 Expression of Notch1, PTEN, p-PTEN, p-Akt protein detected by Western blot

Notch信號通路不僅能夠直接調(diào)控大量的基因表達(dá),而且還可以與其他信號通路(包括TGF-β、NF-κB、Hif-1α等)相互作用而擴(kuò)大其調(diào)控范圍[16-18].近年來,Notch通路與PI3K-AKT等通路之間的互相作用受到廣泛的關(guān)注抑癌基因PTEN在PI3K-AKT信號通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,PTEN的失活會導(dǎo)致PI3K-AKT通路活化,PTEN能夠使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)脫磷酸,使PIP3磷酸化呈低水平,抑制AKT的活化,從而下調(diào)PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達(dá).在PI3K-AKT通路中,PTEN有時候以磷酸化形式(p-PTEN)出現(xiàn),繼而啟動下游級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致一系列生物學(xué)行為的發(fā)生.AKT磷酸化激活下游信號因子活化.本研究檢測Notch1信號通路與PTEN-PI3K/AKT通路的相互作用是否存在交叉調(diào)控,結(jié)果發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組的 p-PTEN、PTEN蛋白表達(dá)量都出現(xiàn)了一定程度的升高,總的PTEN蛋白表達(dá)量增多;與對照組比較,試驗(yàn)組p-Akt的表達(dá)量減少.提示Notch1通路可能通過對抑癌基因PTEN的調(diào)控來影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能,通過PTEN與PI3K/AKT通路存在交叉調(diào)控作用.

Notch信號通路非常復(fù)雜,且調(diào)控機(jī)制目前仍未清楚闡明.Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中非常重要,但是目前該通路的研究以及Notch信號通路與其他信號通路的交叉調(diào)控方面的研究相對較少,希望能后續(xù)進(jìn)一步詳細(xì)闡明Notch信號通路的生物學(xué)作用機(jī)制,填補(bǔ)這一塊研究的空白,為肺癌的靶向治療提供更有力的理論基礎(chǔ).