王鑫 張毅 胡牧 王若天 劉磊 錢坤 李元博 支修益

肺癌是我國以及世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一,其中小細胞肺癌占13%-15%,預(yù)后較差,侵襲性強,與吸煙狀態(tài)相關(guān)[1,2].小細胞肺癌主要分為局限期和廣泛期[3].如果能在疾病較早期對小細胞肺癌預(yù)后有所判斷,制定合理的治療方案積極進行救治,達到改善生活質(zhì)量,延長生存的目的.有研究顯示,某些免疫表型標記物,如神經(jīng)內(nèi)分泌標志物、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor-1, TTF-1)、CD56、P40等在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,并應(yīng)用于臨床病理診斷.TTF-1是一種分子量為40 kDa的核蛋白,是NKx2轉(zhuǎn)錄基因家族的成員之一最常見其在甲狀腺和肺組織中表達,并在甲狀腺和肺組織癌變過程中起著重要的作用,調(diào)控多種基因的表達[4].TTF-1為II型肺泡細胞和Clara細胞的特異性標記物,在肺小細胞癌與肺泡細胞癌中表達率高,目前臨床中常用于非小細胞肺癌病理分型診斷和鑒別診斷的免疫組化標志物有:Napsin A和TTF-1常用腺癌的診斷,CK5/6、p63以及p40常用于鱗狀細胞癌的診斷.而這些指標在小細胞肺癌中的表達如何,特別是小細胞肺癌的預(yù)后中研究較少,部分研究的結(jié)果也并不一致.本研究通過198例小細胞肺癌患者及其癌組織標本的回顧性分析,探討TTF-1、神經(jīng)細胞粘附分子CD56、P40蛋白以及臨床特征在小細胞肺癌預(yù)后中價值,以期為其他研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究對象及資料搜集 收集2009年1月1日-2014年1月1日來首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院胸外科初次就診并確診的小細胞肺癌患者石蠟包埋組織標本及臨床病理資料.患者納入標準:①病例經(jīng)肺穿刺、纖維支氣管鏡或手術(shù)病理標本確診為小細胞肺癌;②石蠟包埋病例肺癌組織標本保存完好,有完整的臨床病歷資料;③年齡>18周歲;④接受以鉑類為基礎(chǔ)的一線藥物聯(lián)合化療,治療方案包括依托泊苷聯(lián)合卡鉑 /順鉑(EP/CE),托泊替康聯(lián)合卡鉑/順鉑(IP/IC);⑤患者有明確的隨訪資料,包括電話、地址等,依從性好.

收集患者的臨床資料,包括采集病例相關(guān)的臨床病理資料,包括年齡、性別、吸煙史、美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)評分、病理類型、是否合并上腔靜脈綜合征及臨床分期.分別根據(jù)第7版美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)國際腫瘤分期進行腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis, TNM)分期以及美國退伍軍人肺癌研究組(Veterans Administration Lung Study Group,VALG)制定的分期進行局限期和廣泛期劃分;根據(jù)ECOG評分標準進行體力狀態(tài)評分.總生存時間(overall survival, OS)定義為患者開始治療至患者死亡或末次隨診時間.無疾病進展時間(progression free survival , PFS)為從第一次給藥至疾病進展或死亡時間.末次隨訪時間為2017年4月.

1.2 實驗方法及試劑 采用免疫組化EnVision兩步法,進行TTF-1、P40、CD56抗體檢測.按照4 μm左右厚度把癌組織切片,經(jīng)過二甲苯中脫蠟、梯度酒精水化、PBS清洗、抗原修復(fù)后,滴加I抗,孵育,滴加增強復(fù)合物,滴加II抗,置于濕盒內(nèi),37oC孵育30 min,PBS清洗后,DAB試劑盒顯色,蘇木精復(fù)染細胞核,鹽酸酒精分化,酒精脫水,二甲苯透明30 min,中性樹膠1滴,蓋波片封片.免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品.

1.3 結(jié)果判定 分別由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生閱片審核.TTF-1、P40蛋白均定位于細胞核,呈棕黃色顆粒,以細胞核中出現(xiàn)棕黃色為陽性細胞.CD56著色部位均在細胞質(zhì)或細胞膜,以細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)背景清晰的黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞.綜合分析整張切片的陽性細胞數(shù)及著色強度:陽性細胞數(shù)<10%,著色較淡者判定為陰性(-);陽性細胞數(shù)≥10%,可見棕黃色顆粒者判定為陽性(+).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計包進行數(shù)據(jù)處理及分析.計量資料用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,用t檢驗比較差別;計數(shù)資料用頻數(shù)(n)和構(gòu)成比(%)表示,用χ2檢驗等非參數(shù)方法比較差別.生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比較采用Log-rank法進行顯著性檢驗.使用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析生存時間和生存狀態(tài)與因素之間的關(guān)系,其中,已經(jīng)死亡和存活作為因變量,其他變量作為自變量,首先進行單因素分析,單因素分析有意義的變量進入下一步的多因素分析,多因素分析采用逐步回歸法.P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料及與TTF-1、CD5、P40表達基本情況 198例小細胞肺癌患者平均年齡(62.7±11.7)歲.其中接受胸部放療者130例(65.7%),未接受者68例(34.3%);接受依托泊苷聯(lián)合卡鉑或順鉑方案(CE/EP)化療者161例(81.3%),托泊替康聯(lián)合卡鉑或順鉑方案(IC/IP)32例(16.2%),其他方案5例(2.5%).截止最后一次隨訪,共有156例死亡,其他42例為截尾數(shù)據(jù),死亡者平均存活天數(shù)為(588.4±498.6)d.TTF-1構(gòu)成比在截尾和死亡的患者中有顯著差異(χ2=6.007,P=0.014)(表1).

表 1 198例小細胞肺癌患者基本情況及TTF-1、CD56、P40表達情況Tab 1 Clinical characteristics and expression of TTF-1, CD56 and P40 in 198 SCLC patients

2.2 病理學(xué)結(jié)果情況 免疫組化染色顯示,198例小細胞肺癌 患者TTF-1、CD56、P40的陽性率分別為73.2%(145/198)、88.4%(175/198)、7.1%(14/198).鏡下觀察絕大部分小細胞肺癌癌組織細胞為小細胞,形態(tài)單一,胞質(zhì)稀少,近乎裸核,核為圓形或者類圓形,染色質(zhì)較為豐富且分布較為均勻,呈細顆粒狀,核膜薄,核仁不明顯;突出特點是大部分組織擠壓較重,形成拉絲的染色質(zhì)條紋,形態(tài)欠清(圖1).

2.3 單因素和多因素素逐步Cox風(fēng)險比例模型分析 分別通過單因素和多因素逐步Cox風(fēng)險比例模型分析,發(fā)現(xiàn)調(diào)整其他因素的影響之后,TTF-1是否陽性為小細胞肺癌患者獨立預(yù)后因素OR=0.665,95%CI:0.472-0.937,P=0.006;CD56、P40表達情況與預(yù)后無相關(guān)性.其他與被調(diào)整的、有顯著性的相關(guān)因素包括:與不吸煙者相比,吸煙指數(shù)≤400組OR=1.72,95%CI:1.061-2.789,P=0.015;與ECOG得分為0者相比,得分為2分的OR=3.551,95%CI:2.133-5.914,P<0.001;疾病處于廣泛期的較局限期的OR=2.487,95%CI:1.793-3.451,P=0.002;合并上腔靜脈壓迫綜合征(superior vena cava syndrome, SVCS)者OR=2.394,95%CI:1.49-3.846,P=0.008(表2).

2.4 生存曲線分析 TTF-1陰性者平均生存天數(shù)為(640.3±87.0)d,陽性者平均生存天數(shù)為(1,063.0±117.5)d,兩者的生存率情況有顯著差異(χ2=5.516, P=0.019)( 圖2).

表 2 小細胞肺癌預(yù)后單因素和多因素Cox風(fēng)險比例模型分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox proportional hazards model analysis of OS for SCLC patients

圖 1 HE染色圖片和部分免疫標記物免疫組化染色圖片 (X200).A:HE染色;B:TTF-1陽性;C:CD56陽性;D:P40陽性.Fig 1 HE staining and biomarker expression by immunohistochemistry(X200). A: HE staining; B: TTF-1 positive; C: CD56 positive; D: P40 positive.

圖 2 不同TTF-1表達的小細胞肺癌患者生存分析Fig 2 Kaplan-Meier curves for SCLC patients according to TTF-1

3 討論

本研究通過198例小細胞肺癌,分析癌組織的免疫表型標記物表達及其他患者臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系.3個免疫組織化學(xué)標志物中,TTF-1、CD56處于較高表達水平,陽性比例超過70%,P40表達水平較低,陽性率僅為7.1%,與其他文獻報道具有一致性.因此通過免疫表型標志物陽性情況可對小細胞肺癌的具有輔助診斷和鑒別診斷作用,當(dāng)然診斷應(yīng)結(jié)合其他小細胞肺癌的臨床特征,最終確診仍要靠病理.小細胞肺癌的預(yù)后與免疫表型標志物及臨床情況等多個因素相關(guān),TTF-1是否陽性為小細胞肺癌患者獨立預(yù)后因素,表現(xiàn)為TTF-1陽性的患者生存期可能更長,其他兩種標志物CD56、P40表達情況與預(yù)后沒有相關(guān).臨床因素方面,與不吸煙者相比,吸煙、ECOG評分、分期是小細胞肺癌的獨立相關(guān)因素,表現(xiàn)為吸煙者、ECOG評分較差、廣泛期患者生存期更短.

TTF-1為甲狀腺特異性增強子結(jié)合蛋白,作為一個核轉(zhuǎn)錄因子,主要在前腦、甲狀腺上皮、胚胎肺泡上皮細胞以及正常成人氣管及肺泡上皮細胞中,尤其是許多肺部腫瘤包括肺腺癌、小細胞肺癌等等[5].TTF-1與癌癥發(fā)生、分化以及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān),在肺癌的診斷和預(yù)后中較為重要,但作用機制不是很清楚.TTF-1是II型肺泡上皮細胞的標志物,參與調(diào)節(jié)肺上皮組織發(fā)育、分化,陽性者可能表示癌組織尚具有部分正常分化能力,侵襲力較弱[6,7].有關(guān)TTF-1與小細胞肺癌預(yù)后的關(guān)系研究較少,結(jié)論也不一致.Kasmann等[8]對放射治療的局限性小細胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn),TTF-1沒有進入預(yù)后的多因素分析模型.Misch等[9]研究認為TTF-1與晚期小細胞肺癌患者預(yù)后沒有顯著相關(guān),但可作為一線化療反應(yīng)的預(yù)測指標.關(guān)于TTF-1和肺癌預(yù)后的關(guān)系在非小細胞肺癌的研究中更加常見,但是研究結(jié)論也存在不一致,有研究發(fā)現(xiàn),Martins等[10]通過51例肺腺癌觀察認為,TTF-1可以作為肺腺癌患者獨立的預(yù)后指標.Yaman等[11]通過80例非小細胞肺癌研究認為,TTF-1與患者的生存相關(guān)沒有顯著性.Tan等[12]隨訪觀察認為,TTF-1陰性表達者非小細胞肺癌更具侵襲性,陽性表達者中位生存期明顯超過陰性表達者,可以作為非小細胞肺癌的預(yù)后指標.

TTF-1表達在不同部位、不同組織、不同器官、不同類型腫瘤是存在差異的,如在肺腺癌中表達率較高,也有研究[13]認為與腫瘤的不同分期有關(guān),在TNM分期越高的小細胞肺癌患者中,陽性率越低.雖然本研究認為TTF-1在小細胞肺癌組織的表達水平較高,陽性率為83%,與其他研究相似,但其表達與年齡、性別、分期等臨床特征無關(guān).高宗煒等[14]研究發(fā)現(xiàn)TTF-1 DNA結(jié)合活性在肺癌組織較高,肺腺癌組織TTF-1 DNA結(jié)合活性光密度值顯著高于其他病理類型.有研究分析非肺來源的小細胞肺癌,認為其他部位的小細胞癌與肺小細胞癌具有不同的標志物表達譜.Ordonez[15]發(fā)現(xiàn)肺外小細胞癌中TTF-1表達陽性率僅為7.4%,顯著低于小細胞肺癌的96%.Yao等[16]對前列腺小細胞癌研究發(fā)現(xiàn),TTF-1陽性率高達83%.因此TTF-1不是某個組織來源的特異性標志物,而與腫瘤細胞來源有關(guān),這主要是神經(jīng)內(nèi)分泌來源的腫瘤細胞.通過分析非肺來源的小細胞癌以及小細胞肺癌中其他神經(jīng)內(nèi)分泌來源標志物也同時可以印證這一點,比如CD56 在本研究中也有較高陽性率.

總之,本研究認為小細胞肺癌中的預(yù)后與TTF-1表達及吸煙、ECOG得分、癌瘤分期、合并SVCS等多個因素相關(guān).TTF-1、CD56、P40等免疫表型標志物在部分小細胞肺癌病理組織中呈現(xiàn)陽性表達,對小細胞肺癌的診斷和鑒別具有輔助作用.但是本研究為單中心、回顧性研究,有一定的局限性,未來還需要前瞻性、大樣本、多中心研究進行驗證.