榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍

染色體畸變分析估算生物劑量的實(shí)踐與體會(huì)

榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍

本文結(jié)合疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)防護(hù)所的日常工作，對(duì)染色體畸變分析估算生物劑量的應(yīng)用和估算方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，分析了當(dāng)前存在的主要問(wèn)題，提出解決的對(duì)策。

染色體制備；染色體畸變分析；生物劑量估算；體會(huì)

近年來(lái)，隨著核技術(shù)與核能的廣泛應(yīng)用，核與輻射事故的潛在危險(xiǎn)悄然增加，再加上國(guó)內(nèi)外加緊對(duì)核恐怖事件的防范，生物劑量估算在核戰(zhàn)爭(zhēng)、放射性事故、職業(yè)和大眾的輻射安全和衛(wèi)生防護(hù)等方面的重要性已被世界各國(guó)所認(rèn)識(shí)和重視。染色體畸變分析用作生物劑量估算已有50多年的歷史，可靠性已通過(guò)大量數(shù)據(jù)得到確認(rèn)，被認(rèn)為在事故劑量估算中是一種最可信賴的輻射生物計(jì)量方法。本文結(jié)合疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)防護(hù)所當(dāng)前的工作任務(wù)，對(duì)染色體畸變分析估算生物劑量在日常工作中的應(yīng)用和估算方法進(jìn)行總結(jié)，將相關(guān)問(wèn)題及建議報(bào)告如下。

1 染色體畸變分析在生物劑量估算中的應(yīng)用

1.1 染色體畸變可作為小劑量輻射生物效應(yīng)的特異性敏感指標(biāo)隨著人們對(duì)電離輻射認(rèn)識(shí)的不斷深入，輻射防護(hù)越來(lái)越受到重視，職業(yè)工作人員的防護(hù)意識(shí)也逐漸提高。放射工作人員所受的職業(yè)危害主要是長(zhǎng)期的慢性小劑量電離輻射，一般認(rèn)為，累積劑量低于100 mGy時(shí)，染色體畸變沒(méi)有明顯改變，當(dāng)累積劑量大于100 mGy時(shí)，染色體畸變就可能明顯增加[1]。但近年來(lái)，多家機(jī)構(gòu)調(diào)查顯示，不同工種放射工作人員的淋巴細(xì)胞染色體畸變率均高于正常人群，而且可能隨著工齡的增加而逐漸增高[2-4]。因此，目前染色體畸變作為評(píng)價(jià)放射工作人員受照效應(yīng)的一種簡(jiǎn)單而有價(jià)值的遺傳學(xué)指標(biāo)被應(yīng)用于職業(yè)健康體檢中。

1.2 染色體畸變分析在輻射事故中的應(yīng)用生物劑量估算是核事故醫(yī)學(xué)應(yīng)急體系中非常重要的組成部分。用非穩(wěn)定性染色體畸變估算事故受照者的生物劑量，在國(guó)內(nèi)多次輻射事故處理過(guò)程中都起到了非常重要的作用[5-6]。輻射事故中，生物劑量可以和物理劑量互相驗(yàn)證，互相補(bǔ)充。當(dāng)未佩戴個(gè)人劑量計(jì)、無(wú)法用物理方法提供劑量時(shí)，或者估算的物理劑量與臨床表現(xiàn)不符合時(shí)，染色體畸變分析被認(rèn)為是較為靈敏、估算劑量較可靠的首選方法。

2 染色體畸變分析估算生物劑量的方法

依據(jù)GBZ/T 248-2014《放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變檢測(cè)與評(píng)價(jià)》、GB/T 28236-2011《染色體畸變估算生物劑量方法》，參照相關(guān)專著[7-8]，并結(jié)合作者的實(shí)踐總結(jié)如下。

2.1 外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備（1）采血：采集靜脈血2 ml，予肝素抗凝。（2）培養(yǎng)：無(wú)菌條件下接種0.4 ml抗凝血至市售5 ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入秋水仙素，使其濃度為0.03 mg/L，充分混勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～52 h后收獲。（3）低滲：終止培養(yǎng)后吸去上清培養(yǎng)液，加入預(yù)溫37℃的0.075 mol/L氯化鉀低滲液8 ml，移入離心管，混勻后置37℃水浴中放置30 min。（4）預(yù)固定：低滲取出后立即加入固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）1 ml輕輕混勻，1000 rpm離心10 min。（5）固定：吸去上清液，加入固定液8 ml混勻，室溫靜置30 min，然后1000 rpm離心10 min。棄固定液，以同樣方法再固定一次。（6）制片：吸棄固定液，根據(jù)沉淀物多少加入少量固定液，混勻，靜置10 min。將細(xì)胞懸液滴在冰水浸泡的玻片上，每片3滴，酒精燈上過(guò)火1～2次，然后自然干燥。（7）染色：Giemsa原液與磷酸緩沖液1:9混合配制染液，常規(guī)染色8 min左右，自來(lái)水沖洗玻片背面，置晾片架上晾干后待鏡檢。

2.2 染色體畸變分析在低倍鏡下尋找分散良好、長(zhǎng)短適中的分裂相，換用油鏡對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)觀察，分析和記錄（46±1）個(gè)染色體的中期細(xì)胞。電離輻射誘發(fā)的畸變主要是染色體結(jié)構(gòu)的改變，包括染色單體型畸變和染色體型畸變。由于大部分化學(xué)誘變劑和環(huán)境中一些有害因素均可誘發(fā)單體畸變，故一般認(rèn)為單體型畸變對(duì)輻射效應(yīng)評(píng)價(jià)意義不大。而染色體型畸變又可分為非穩(wěn)定性畸變和穩(wěn)定性畸變兩類，前者包括雙著絲粒（dic）、著絲粒環(huán)（r）和無(wú)著絲粒片段（ace），后者包括相互易位（t）、倒位（inv）和缺失（del）。放射工作人員職業(yè)健康檢查時(shí)主要分析計(jì)數(shù)dic、r和ace，以及明顯的非對(duì)稱性的t和del等。輻射事故生物劑量估算時(shí)只計(jì)數(shù)dic或dic+r，ace作為輔助指標(biāo)。

2.3 放射工作人員染色體畸變檢測(cè)評(píng)價(jià)職業(yè)健康體檢時(shí)，每名受檢者至少分析100個(gè)中期分裂細(xì)胞。ace率大于3%，dic率、r率和t率大于或等于1%均為異常。作為慢性放射病診斷指標(biāo)時(shí)還需至少增加分析100個(gè)中期分裂細(xì)胞。

2.4 輻射事故生物劑量估算根據(jù)鏡檢所得的dic或dic+r的畸變率，從相應(yīng)射線所建立的刻度曲線回歸方程估算受照劑量平均值，同時(shí)給出劑量范圍的95%可信區(qū)間。對(duì)估算劑量的個(gè)體，至少分析300～500個(gè)中期分裂細(xì)胞。但當(dāng)大劑量急性照射時(shí)，通常分析100～200個(gè)中期分裂細(xì)胞就可滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

3 染色體畸變分析估算生物劑量存在的難點(diǎn)及制定對(duì)策

3.1 染色體畸變標(biāo)本制備成功的關(guān)鍵點(diǎn)染色體畸變是反映輻射損傷的良好指標(biāo)，也是受人為影響很大的一項(xiàng)檢查。染色體標(biāo)本制備從采血、培養(yǎng)、制片到分析全部為人工操作，環(huán)節(jié)多，時(shí)間長(zhǎng)，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)處置不當(dāng)都會(huì)影響畸變細(xì)胞的檢出率。應(yīng)特別注意以下這些方面：（1）收獲細(xì)胞前的所有步驟要保持無(wú)菌操作，防止污染。（2）加血量要適中。血液太少，細(xì)胞稀薄，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢；血液太多，會(huì)造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不夠，影響其生長(zhǎng)狀態(tài)。（3）秋水仙素的濃度和作用時(shí)間要準(zhǔn)確控制。秋水仙素濃度過(guò)高，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不但產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用使分裂相減少，而且染色體過(guò)于縮短，不宜進(jìn)行分析；反之則不能有效阻斷細(xì)胞分裂，染色體瘦長(zhǎng)或無(wú)中期分裂相。（4）低滲濃度和時(shí)間要適當(dāng)。低滲過(guò)度，可使核膜破裂，染色體丟失；低滲不足則細(xì)胞膨脹不夠，染色體分散不開(kāi)。（5）固定液要新鮮配制，否則會(huì)形成酯類，從而影響固定效果。（6）載玻片一定要非常干凈，并且經(jīng)0℃預(yù)冷，滴片時(shí)距離不小于50 cm，均有利于染色體的分散。此外，整個(gè)制備過(guò)程還需注意操作手法，減少不必要的細(xì)胞丟失。

3.2 染色體畸變分析估算生物劑量存在的問(wèn)題（1）制片質(zhì)量的優(yōu)劣影響閱片效率和畸變的檢出率。由于染色體實(shí)驗(yàn)影響因素眾多，制片質(zhì)量往往不穩(wěn)定，特別是在季節(jié)交替、溫濕度變化大的季節(jié)，或是某個(gè)試劑更換批次時(shí)，如不能及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，制片效果就會(huì)不近人意，從而影響染色體的顯微觀察。（2）不同經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員判定畸變的準(zhǔn)確率差異大。判斷染色體畸變需要分析人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)，一般有經(jīng)驗(yàn)的分析人員dic+r畸變的準(zhǔn)確率要高于新參加人員[9]。（3）多數(shù)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有建立自己的劑量曲線。盡管用于生物劑量估算的染色體標(biāo)本制備技術(shù)已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于畸變的描述也很清楚，但是這項(xiàng)技術(shù)完全是手工操作，尤其是畸變的判斷也全憑個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，因此如果不是用自己建立的劑量曲線估算，即使是同一劑量的標(biāo)本，不同實(shí)驗(yàn)室的估算結(jié)果也會(huì)有較大差異。

3.3 染色體畸變分析估算生物劑量難點(diǎn)制定對(duì)策（1）要想獲得高質(zhì)量的染色體片，必須做好染色體標(biāo)本制備的質(zhì)量控制工作。染色體畸變標(biāo)本制備的每個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，出現(xiàn)失誤會(huì)影響最終制片效果，增加觀察的難度和檢查結(jié)果的偏離。因此必須從人員到設(shè)備、試劑、操作過(guò)程都嚴(yán)格按照質(zhì)量手冊(cè)規(guī)范，并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，做好室內(nèi)質(zhì)控。（2）培養(yǎng)穩(wěn)定的團(tuán)隊(duì)，通過(guò)集中學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，加強(qiáng)技術(shù)人員業(yè)務(wù)知識(shí)培訓(xùn)，使之熟練掌握染色體標(biāo)本制備技術(shù)和判斷、識(shí)別各種染色體畸變類型的能力，提高制片成功率和分析結(jié)果的準(zhǔn)確率。目前，很多單位使用染色體自動(dòng)掃描成像系統(tǒng)，這對(duì)制片和閱片的要求更高。（3）最大限度統(tǒng)一畸變分析標(biāo)準(zhǔn)，建立共同的劑量-效應(yīng)曲線。原則上劑量-效應(yīng)曲線的建立和劑量估算的分析人應(yīng)為同一人，這樣才能保證判斷標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，但實(shí)際情況一般不能滿足該條件，這就需要實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和實(shí)驗(yàn)室之間判斷標(biāo)準(zhǔn)盡量一致。通過(guò)定期進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行質(zhì)量控制，然后逐步建立起較為一致的劑量-效應(yīng)曲線，不僅能夠提升各實(shí)驗(yàn)室生物劑量估算能力，還可提高同一時(shí)期樣本的處理量，為應(yīng)對(duì)大規(guī)模核與輻射事故的醫(yī)學(xué)救援工作做好技術(shù)準(zhǔn)備。

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（收稿：2016-11-10修回：2016-12-26編校：丁艷玲）

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2095-3496（2017）01-0040-03

10.19372/j.cnki.issn.2095-3496.2017.01.016

210002江蘇南京，原南京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心（榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍）

楊龍，E-mail：nanjing.1978@163.com