張立蘋 鄭新民

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430064）

品種繁育

體細(xì)胞核移植技術(shù)在豬育種上的應(yīng)用

張立蘋 鄭新民*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430064）

基因工程帶動了生物工程的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在改良家禽品種上得到廣泛的應(yīng)用。本文就體細(xì)胞克隆豬的關(guān)鍵技術(shù)加以論述。

體細(xì)胞；核移植；豬

育種學(xué)家多年以來都致力于通過各種育種手段來改良家禽及豬的優(yōu)良品種，大多數(shù)育種學(xué)家都采用傳統(tǒng)的育種手段——挑選優(yōu)良品種的豬種進(jìn)行雜交而得到優(yōu)良的豬種。但此方法效率很低，一個品種的培育需要十年甚至更長時間，且在培育過程中很可能把不良的性狀傳給后代，不能按人們的意愿定向改良豬的特性。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家將轉(zhuǎn)基因技術(shù)和現(xiàn)代繁殖技術(shù)應(yīng)用于豬的育種上，這大大縮短了育種周期，而且還能將人們所需性狀的目的基因轉(zhuǎn)移到豬種上，基本實現(xiàn)定向改良的目的。

1997年，世界首例體細(xì)胞核移植后代“多莉”的克隆成功，成為生命科學(xué)研究的一個里程碑。隨后，世界各國掀起了體細(xì)胞克隆研究的熱潮，小鼠[1]、牛[2]和山羊[3]等動物體細(xì)胞核移植后代相繼誕生，體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因豬的研究也得到快速發(fā)展。本文就體細(xì)胞克隆豬的關(guān)鍵技術(shù)加以論述。

1 受體細(xì)胞(豬卵母細(xì)胞)的準(zhǔn)備

1.1 卵母細(xì)胞的來源

利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得克隆豬需要大量的成熟卵母細(xì)胞，獲得體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的操作繁瑣、成本較高、數(shù)量較少。目前，用于體細(xì)胞核移植所需要的卵母細(xì)胞一般來源于體外培養(yǎng)的成熟卵母細(xì)胞，即采用屠宰場廢棄的豬卵巢上抽取的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟后，作為體細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞。

1.2 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)

豬卵母細(xì)胞的體外成熟是豬體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)。目前，一般采用的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)條件為：39℃，5%CO2，95%空氣，培養(yǎng)時間為42～44小時。卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)基，現(xiàn)在普遍采用NCSU-23。

1.3 成熟卵母細(xì)胞的處理

將成熟培養(yǎng)44小時的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexes,COCs）移入含0.1%透明質(zhì)酸酶的DPBS中消化并用移液槍反復(fù)輕微吹打以除去卵丘細(xì)胞，用已經(jīng)在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡2小時以上的操作液洗滌3次后備用。

2 供體細(xì)胞的選擇與制備

體細(xì)胞核中含有物種特有的遺傳信息，因此，體細(xì)胞核移植技術(shù)中，供體細(xì)胞的選擇和制備是體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)的重要組成部分。一般而言，根據(jù)試驗的目的選擇相應(yīng)的個體。豬體細(xì)胞核移植發(fā)展較晚，目前，豬體細(xì)胞核移植以胎兒成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞作為供體較多。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在核移植技術(shù)中現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[4]。研究表明，G0期或G2/M期的供體細(xì)胞均能有效地在受體中進(jìn)行正常核的重編程。

3 核移植操作技術(shù)

體細(xì)胞核移植的顯微操作由去核和移核兩部分工作組成。去核即去除成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的核遺傳物質(zhì)，目前，常用的去核方法有盲吸法（即用顯微操作儀將核吸出[5-7]，用X線照射的方法去核[8]，是應(yīng)用秋水仙胺的化學(xué)去核方法）、紡錘體探測法、熒光染色去核法等幾種。其中，盲吸法的應(yīng)用最為普遍。移核的方法主要有透明帶下注射和胞質(zhì)內(nèi)注射兩種，其中胞質(zhì)內(nèi)注射一般用壓電-陶瓷系統(tǒng)直接把供體細(xì)胞核注入胞質(zhì)內(nèi)；透明帶下注射是把整個供體細(xì)胞注射至卵母細(xì)胞的卵周隙，然后再進(jìn)行融合[9]。

4 重構(gòu)胚胎的人工激活

利用理化因素的卵子激活即卵母細(xì)胞的人工激活，卵子人工激活得到的胚胎是人工孤雌生殖的產(chǎn)物。細(xì)胞核移植的效率與重構(gòu)卵的電融合以及激活的效率緊密相關(guān)。提高融合率，是提高核移植效率的主要途徑之一。常用的激活方法可歸納為物理激活、化學(xué)激活以及物理和化學(xué)聯(lián)合激活等幾種。激活途徑有兩種，一是鈣離子信號通路，鈣離子載體和電刺激等通過激發(fā)單脈沖性鈣離子升高而實現(xiàn)。二是MAPK通路，蛋白質(zhì)合成抑制劑、蛋白磷酸化抑制劑等通過調(diào)節(jié)蛋白激酶或蛋白磷酸酶活性，降調(diào)MPF、CSF而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活。

5 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)

目前，豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)一般用PZM-3或NCSU-23培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法主要有微滴培養(yǎng)法（是應(yīng)用最廣泛、最簡單的一種胚胎培養(yǎng)方法）、套皿培養(yǎng)法、微穴培養(yǎng)法（Vajta等[10]在牛體外受精合子的培養(yǎng)中最早使用）、玻璃微管培養(yǎng)法（Thouas等[11]在研究小鼠合子的發(fā)育培養(yǎng)時首次應(yīng)用）、明膠孔培養(yǎng)法等。

6 胚胎移植

豬胚胎的移植方法有非手術(shù)法、內(nèi)窺鏡法和手術(shù)法等。最早開展非手術(shù)法豬胚胎移植的是Polge等[12]，他們得到了一頭妊娠母豬，屠宰后發(fā)現(xiàn)有3枚胚胎。內(nèi)窺鏡法的使用與術(shù)者的熟練程度密切相關(guān)，對術(shù)者的技術(shù)水平要求較高，因此采用這種技術(shù)，妊娠率的差別很大。目前，豬胚胎的移植，尤其是轉(zhuǎn)基因胚胎的移植一般采用手術(shù)法。核移植重構(gòu)胚胎移植數(shù)量一般在100枚以上。其中，1～4細(xì)胞期的重構(gòu)胚胎移入受體母豬的輸卵管內(nèi)，8細(xì)胞期及以上發(fā)育階段的重構(gòu)胚胎應(yīng)移入受體母豬的子宮角內(nèi)。

7 結(jié)語

目前，豬的體細(xì)胞核移植技術(shù)已取得了明顯進(jìn)展，雖然還存在克隆效率低、克隆動物體細(xì)胞突變等問題，但是，使用該技術(shù)可以對豬基因組進(jìn)行定點修飾，隨著該技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，我們相信，體細(xì)胞核移植技術(shù)在豬的遺傳改良中仍具有廣闊的應(yīng)用前景。未來這一技術(shù)必將極大地促進(jìn)和推動轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

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轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08006001-005），湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（2017-620-004-001），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2016NKYJJ19），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性項目（2016jzxjh013），湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項重大項目（2016ABA117）

張立蘋（1982-），女，河北邢臺人，主要從事動物生物技術(shù)研究，E-mail：chzlp1982@163.com

*通迅作者：鄭新民，研究員，主要從事動物生物技術(shù)研究，E-m ail：anb it20@163.com