鄧奇風 陳頎 劉志強

（湖南九鼎動物營養(yǎng)研究院有限公司，湖南長沙410003）

豬病防控

菌影的研究進展及其在豬生產(chǎn)中的應用

鄧奇風 陳頎 劉志強*

（湖南九鼎動物營養(yǎng)研究院有限公司，湖南長沙410003）

菌影是細菌在外界因素干擾下，其核酸等內(nèi)含物流失而形成的空殼。菌影具有細菌完整的細胞膜結構，保留了細菌原有的形態(tài)、黏附性和抗原特性，是一種生物安全性高、誘導機體免疫應答效果好的免疫促進劑。本文就菌影的形成機制與制備、使用途徑及在豬生產(chǎn)中的應用進行綜述，以促進菌影在養(yǎng)豬業(yè)的推廣應用與研究。

菌影；形成機制；制備；豬；應用

目前，我國養(yǎng)豬業(yè)在應對細菌性疾病的預防和治療中，抗生素仍然是首選藥物，這造成了抗生素的濫用。而抗生素濫用可通過抗原抗體反應、肉產(chǎn)品藥物殘留、糞污排入環(huán)境等多種途徑導致環(huán)境中細菌耐藥性普遍增強，使得人類生存環(huán)境存在很大的衛(wèi)生安全隱患。隨著抗生素在養(yǎng)豬業(yè)的不斷限用和整頓，研發(fā)能替代抗生素的無毒無殘留的綠色藥物是養(yǎng)豬業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展道路上的重要一環(huán)。開發(fā)有效的菌苗用以應對細菌性疾病也是抗生素替代或減量使用的一個研究熱點，其中菌影（bacterial ghosts,BGS）是通過噬菌體Phi X174的E基因在革蘭氏陰性菌中表達，使細胞內(nèi)外膜融合形成跨膜通道，細胞的滲透壓發(fā)生改變后其基因組和胞漿等內(nèi)含物通過跨膜通道流出，剩下的細菌空殼[1-2]。與傳統(tǒng)的常規(guī)滅活方式制得的滅活菌苗相比，菌影制備的優(yōu)勢在于利用非變性基因滅活，制備的菌影具備細菌的各種抗原成分和免疫黏附分子的特性，有更好的免疫促進功效，還能消除滅活菌苗引發(fā)的耐藥性和毒性的潛在風險。因此，菌影較傳統(tǒng)的滅活菌有更好的免疫效果和更高的生物安全性[3-5]。由于菌影疫苗可發(fā)酵進行大量生產(chǎn)，且制成凍干苗可在室溫下長期保存，還不需要添加佐劑，這些優(yōu)勢促成了菌影疫苗成為一項研究開發(fā)新型基因工程疫苗的平臺技術[6-8]。本文對菌影的形成機制、制備方法和使用方法進行簡要闡述，并綜述了其在豬生產(chǎn)中的應用。

1 菌影的形成機制

目前，菌影的常見制備方法有：基因工程方法、物理方法和化學方法。三種方法共同之處在于以不同機制作用于細胞膜，使膜通透性發(fā)生改變，促使胞質(zhì)內(nèi)容物排出，但不同方法作用機制不同。筆者認為，化學方法和傳統(tǒng)滅活方法具有相似性，化學試劑具有殺菌及殘留特征，不太符合菌影生物安全性高的特性，在此不作介紹。目前菌影的形成機制主要分為以下兩種。

1.1 噬菌體Phi X174裂解基因E編碼蛋白裂解機制

噬菌體Phi X174裂解基因E在限制性溫控表達系統(tǒng)λp L/pR-c I857的調(diào)控下，當溫度超過30℃時，阻遏蛋白c I857的活性急劇下降甚至失活，E基因在抑制因素解除后在細菌細胞內(nèi)轉錄翻譯，經(jīng)蛋白質(zhì)合成得到E蛋白[9]。E蛋白可作用于革蘭氏陰性菌細胞膜，實現(xiàn)革蘭氏陰性菌內(nèi)外膜融合，形成特異性跨膜孔道。噬菌體Phi X174裂解基因E編碼蛋白裂解機制為：E蛋白整合到內(nèi)膜后構象發(fā)生改變，可能原因是E蛋白在第一次穿膜時卡在膜中的α螺旋結構的第21位脯氨酸殘基順反異構后羧基端易位到細菌的外膜上，從而實現(xiàn)內(nèi)外膜的融合過程[10]。當膜通透性發(fā)生改變后，在高滲透壓的作用下，細胞膜吸水脹破，細胞內(nèi)含物經(jīng)勢能流出細胞外，最后只剩下一個細菌空殼。

1.2 抗菌肽作用機制

抗菌肽（AMPs）是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì),它是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可人工合成亦可體外誘導表達。抗菌肽對細菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細胞等有著廣泛的抑制作用。其機制為：抗菌肽在細菌細胞膜上形成某些離子通道，細胞膜隨后發(fā)生穿孔現(xiàn)象，使細胞內(nèi)含物流出，最后形成具備細菌的各種抗原成分和免疫黏附分子等特性的空殼細胞。

2 菌影的制備

2.1 基因工程方法

基因工程制備菌影是最經(jīng)典和常用的方法，主要通過重組質(zhì)粒、基因重排技術、提高質(zhì)粒轉化技術和電擊法等技術來提高菌影的制備效率，以滿足疫苗的規(guī)?；a(chǎn)需求。黃春艷等[5]用裂解基因E與PBV220載體構建重組質(zhì)粒，導入大腸埃希菌O157∶H7，制得該菌菌影，但這一方法的裂解效率低于97%?；蛑嘏偶夹g也是菌影制備的一種基因工程方法，有研究通過基因重排技術對裂解基因E的基因重排制定文庫，從中篩選出了一種含E基因突變體的溶菌質(zhì)粒，然后利用質(zhì)粒重組技術，導入大腸埃希菌和沙門氏菌內(nèi)，結果表明兩種菌的裂解效率明顯提高[11]。Peng等[12]利用pBV-m E質(zhì)粒成功制備出了腸炎沙門氏菌菌影疫苗。王麗哲等[13]將E基因與SN基因（金黃色葡萄球菌核酸酶A基因，這一基因的功效是能表達出一種蛋白，將DNA分解成小片段）利用柔性氨基酸串聯(lián)的方法，成功構建出2個串連融合的表達載體，再利用SN基因的特殊功效，菌體裂解率大幅度提升，最高可達99.9%。此外，通過改善溶菌質(zhì)粒的轉化效率有利于提高菌體的裂解率。通過構建穿梭載體，采用接合轉化法將質(zhì)粒融合到傳染性胸膜肺炎放線桿菌中，能制出該菌菌影[14]。

對于非工程菌或難以構建合適穿梭載體的細菌，只能通過其他方法將質(zhì)粒打入受體菌，電轉化方法進入了研究工作者的視野。常月紅等[15]用裂解基因E與PBV220載體構建重組質(zhì)粒，利用電擊法轉入打孔質(zhì)粒，成功制備了胸膜肺炎放線桿菌的菌影。胡明明等[16]利用電擊法將有裂解基因E的重組質(zhì)粒轉入副豬嗜血桿菌，成功制備出副豬嗜血桿菌的菌影。但當碰到有莢膜的細菌或細胞壁較厚的細菌時，電擊法的作用發(fā)揮便有一定困難。王勇[17]用電轉化的方式通過制備鴨疫里默氏桿菌（RA）原生質(zhì)體，在這一基礎上再利用基因重組技術成功制得RA菌影。還有運用多種基因工程方法組合的菌影制備，如劉東勝等[18]把E基因、λp L/pR-c I857和質(zhì)粒pPBA1100基因進行雜交，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶和瓊脂糖電泳兩種鑒定得到陽性重組子，將此陽性重組子轉入受體中，通過溫度調(diào)節(jié)便可成功制得多殺性巴氏桿菌的菌影疫苗。

2.2 抗菌肽處理

雷連成等[19]用抗菌肽處理豬胸膜肺炎放線桿菌、枯草桿菌和大腸桿菌O138等菌體來制備細菌菌影，但細菌裂解率低于98%。為了提高對菌體的裂解率，超高壓技術與抗菌肽聯(lián)用被引入菌影的制備。超高壓技術是目前廣泛應用的冷殺菌技術，其作用于細菌后使細菌的細胞形態(tài)結構發(fā)生改變，從而使細胞膜破裂或變形，細胞內(nèi)物質(zhì)流出。胡本鋼[20]運用超高壓技術與抗菌肽聯(lián)用制備出肺炎克雷伯菌和副豬嗜血桿菌的菌影，獲得良好的效果，兩種細菌裂解率均達到100%。這一方法操作簡單易行，不需要載體構建、基因串聯(lián)表達裂解等復雜的生物工程技術，也能制備出裂解率高的菌影，為菌影疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了基礎研究。筆者認為，利用超高壓技術會改變細菌的細胞形態(tài)結構，從而造成菌影效果下降，因此，抗菌肽處理技術只能作為制備細菌菌影的補充，可與基因工程法聯(lián)用。

3 菌影的使用途徑

3.1 菌影疫苗

菌影具有完整的細菌細胞膜表面抗原特性，可同時誘導機體的體液、細胞免疫應答及增強黏膜免疫反應，所以可作為疫苗使用。雖然多種革蘭氏陰性菌細菌菌影成功的制備方法已有大量報道，但從菌影的制備到疫苗的制備還需要大量的研究工作參與。目前已有幽門螺旋桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、傷寒沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、李斯特菌、弗氏志賀菌、腸炎沙門氏菌和大腸埃希菌等八種菌影疫苗研究，并成功制出了菌影疫苗[21-24]。其中，只有幽門螺旋桿菌菌影作為疫苗在臨床上取得良好的免疫效果[25]。

3.2 載體

目前在菌影上的研究主要集中在菌影疫苗上，但由于菌影獨特的形態(tài)結構可作為一種有效的運載系統(tǒng)攜帶外源物質(zhì)進入機體內(nèi)，也有關于外源物質(zhì)的研究，已有研究的外源物質(zhì)包括亞單位疫苗、核酸和藥物等。

外源目標抗原可以錨定在菌影表面，或者通過與外膜蛋白N端或C端結合錨定在菌體細胞膜內(nèi)[26-27]。已有研究證實，這些錨定作用不會影響插入抗原的正確折疊，可以保持構象表位結構的完整性和酶的活性，還能更好地調(diào)控抗原的組裝和分類[26]。目前研究較為通透的外源目標抗原錨定方式主要有周質(zhì)間隙、S層蛋白基質(zhì)兩種。比如，靶抗原載入菌影的周質(zhì)間隙，可阻止因外環(huán)境因素或者冷凍干燥程序引起的抗原降解和失效，從而為抗原產(chǎn)品的制備提供良好的保障。此外，細胞膜表面的S層蛋白基質(zhì)的六角排列（SbsA）和斜方排列（SbsB）是菌影內(nèi)殼中片狀自行組裝的兩種結構，可視為天然的載體倉庫。

菌影還能作為DNA編碼抗原的載體。DNA疫苗是一種新型疫苗，在動物預防與治療疾病方面發(fā)揮著巨大作用，但DNA疫苗的低免疫原性和質(zhì)粒劑量需求大的特征限制其發(fā)展。如果將DNA疫苗（質(zhì)粒DNA）載入菌影細胞內(nèi)，利用菌影的靶向性特征，能將DNA疫苗高效、快速地遞送到動物指定細胞內(nèi)并進行抗原的表達[28]。這一過程中經(jīng)特定篩選的菌影與DNA疫苗存在協(xié)同作用，能促進機體免疫反應，克服常規(guī)DNA疫苗細胞吸收量少，難以達到足夠免疫刺激劑量的缺陷。Wen等[29]用裝載HIVgp 140 DNA疫苗的Ty21a沙門氏菌菌影針對性轉染小鼠巨噬細胞RAW 264.7時發(fā)現(xiàn)，菌影能被有效攝取，且與裸露DNA疫苗相比，這一菌影疫苗免疫小鼠后能引起強烈的全身和局部抗體gp 140抗體的反應。

菌影可作為藥物載體，在菌影細胞膜表面，SbsB的p2晶格、SbsA的p6晶格兩種晶格都是良好的載體空間，但p6晶格能夠插入更多的外源物質(zhì)[30]。菌影強大的裝載能力還能提高局部藥物濃度。這一特殊結構促成了菌影作為藥物載體能有效減少常規(guī)用藥中的用藥劑量和藥物的副作用。同時，菌影作為藥物載體有穩(wěn)定的緩釋作用，可使藥物對靶細胞作用持久[31]。Paukner等[32]研究表明，溶血性曼氏桿菌菌影裝載抗腫瘤藥物DOX能靶向性到達人結腸癌細胞，并能將DOX有效緩慢地釋放入細胞中，顯示出雙對數(shù)增長的抗細胞毒的增值能力。

4 菌影在豬生產(chǎn)中的應用

菌影的使用途徑眾多，但在豬生產(chǎn)中的應用研究較少。菌影作為DNA編碼抗原載體的研究主體動物一般為小鼠和兔，而現(xiàn)階段作為藥物載體使用的基本方向為人類疾病治療。目前，菌影作為疫苗或免疫促進劑在豬生產(chǎn)中的應用主要集中在胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌兩種致病菌上。

Hensel等[33]在1996年首次描述了APP菌影疫苗對豬的免疫效果，用APP菌影疫苗制成氣霧劑對豬只噴灑免疫后，用同型菌攻擊免疫豬只均未感染，且從免疫豬只扁桃體、肺臟、肺氣泡洗出物中均沒有分離到攻毒病株。并在此基礎上利用APP菌影建立了豬肺部感染模型。Katinger等[34]對比研究APP菌影和傳統(tǒng)滅活株免疫豬群效果，攻毒結果顯示，菌影組能完全抵抗因該病原體繁殖所患有的胸膜炎癥，而滅活疫苗免疫組保護性明顯差于菌影組；測量兩組豬只血液中免疫指標顯示，滅活疫苗組豬只產(chǎn)生IgG和IgA的抗體水平高于菌影組。但測量豬只支氣管肺泡內(nèi)層液體免疫指標表明，菌影組中IgG、IgA、淋巴細胞和顆粒細胞數(shù)量顯著提升（＜0.05）。有研究者利用血清5型App制得的APP菌影疫苗對健康易感仔豬接種免疫，免疫后14天攻毒結果顯示，菌影組血清中IgG、IL-2、IL-4、IgM、IgA含量均顯著（＜0.05）高于對照組；在攻毒過程中還發(fā)現(xiàn)，血清5型APP疫苗還能對血清7型APP感染有交叉保護作用[35]。還有研究者應用代表性差異分析和生物信息學兩種組合分析方法建立了APP菌影疫苗，并成功構建了免疫接種仔豬前后淋巴細胞基因差異的表達文庫，在其中共篩選和鑒定出菌影疫苗免疫接種后的11條上調(diào)表達基因。這一成果為研究淋巴細胞對APP菌影疫苗產(chǎn)生的特異性免疫應答機理提供了良好的研究基礎，為探究APP菌影疫苗免疫接種仔豬的應答機制貢獻巨大。在Hps菌影研究方面，胡明明等利用電擊法轉入打孔質(zhì)粒獲得Hps菌影疫苗，利用Hps菌影疫苗與Hps滅活疫苗接種幼年豬，攻毒結果表明，菌影組的免疫效果明顯優(yōu)于滅活疫苗組。這一研究成果為Hps新型、高效的菌影疫苗的研制開發(fā)和應用提供了基礎，同時也為其他菌影疫苗的提供了思路。

此外，菌影在豬生產(chǎn)中的劑量安全及使用方式效果也有相關研究。有研究應用菌影作用于動物口腔、呼吸道黏膜表面，結果顯示，在引起免疫應答的劑量范圍內(nèi)，對動物無不良反應。將菌影與細胞進行組織培養(yǎng)顯示，高劑量條件下（1000菌影/細胞），菌影仍不會造成細胞毒性或遺傳毒性。菌影的來源與遞送方式直接影響菌影的使用效果。有研究表明，出血性大腸桿菌菌影應用直腸免疫，能使動物能獲取100%的免疫。Hps通過注射免疫，可引起豬DC表面表達共刺激分子和MHC分子明顯增加。因此，對不同菌影候選疫苗的劑量和免疫途徑還需要更多的深入研究。

5 展望

菌影的研究與應用不僅可減少動物細菌性病菌預防與治療時抗生素的使用，還為動物用新型疫苗的研制提供了新的模式，其在未來動物疫病疫苗及免疫促進等方面具有廣闊的發(fā)展前景。目前，菌影在豬生產(chǎn)中試驗效果較好，但應用較少見，這可能與菌影制備成本過高、有些細菌菌影制備困難有關。筆者認為，未來菌影在豬只上的研究將逐步增多，菌影產(chǎn)品工藝也將不斷改良，規(guī)?；a(chǎn)使得菌影成本降低。適宜成本的菌影將在豬疫病的綜合防控上表現(xiàn)出更加理想的價值，甚至可制備成動物保健產(chǎn)品應用于豬生產(chǎn)中。

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S816.73

A

1673-4645(2017)09-0054-05

2017-05-04

鄧奇風（1990-），男，湖南婁底人，碩士，主要從事飼料配方技術研究，E-m ail：1204194718@qq.com

*通訊作者：劉志強（1979-），男，博士，E-mail：liuzhiqiangxy@126.com