吳修紅，趙闖，孫曉蘭，胡妮娜，張金琦，王旭，孫澤，孫暉

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

綜 述

基于代謝組學方法的中藥藥效物質基礎研究進展

吳修紅，趙闖，孫曉蘭，胡妮娜，張金琦，王旭，孫澤，孫暉*

(黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來，代謝組學已經(jīng)成為科學研究中的一大熱點，隨著學者們對代謝組學的深入研究，代謝組學也滲透到各個領域，如藥物的物質基礎研究、針灸學、毒理學、疾病診斷學等。通過對近幾年相關文獻的查閱，發(fā)現(xiàn)代謝組學在中藥的物質基礎研究方面，也發(fā)揮著至關重要的作用，因此，將相關研究進行整合歸納，以期為代謝組學的進一步研究作參考。

代謝組學；代謝物；生物標志物；物質基礎；核磁共振氫譜

中藥藥效物質基礎是關系到中藥的有效性及安全性等質量問題的關鍵因素，其研究和確認的技術與方法事關中藥發(fā)展的關鍵[1]。最近，代謝組學在揭示中藥藥效物質基礎也起到了重要作用。它是在基因組學和蛋白質組學之后，一門新興“組學”學科，是系統(tǒng)生物學重要組成之一，廣泛應用到科學研究領域。代謝組學能夠從整體水平反映疾病治療過程中的小分子代謝物的變化，采用核磁共振氫譜，色譜-質譜聯(lián)用技術，對實驗動物的尿液、血清、血漿等樣本檢測，通過主成分分析或偏最小二乘法等多元數(shù)據(jù)處理方法，從而發(fā)現(xiàn)藥物中潛在的生物活性物質，更準確地反映生物體系的狀態(tài)[2]。為解釋中藥藥理作用的物質基礎以及系統(tǒng)分析中藥的化學組成做出了貢獻。因此，代謝組學在中藥物質基礎研究中也是不可或缺的一部分。

1 代謝組學在中藥單味藥藥效物質基礎中的應用

1.1 姜炭

姜炭(Ginger charcoal)是常用中藥，在《神農本草經(jīng)中》有所記載，主要用于溫經(jīng)止血、溫脾止瀉。莫毛燕等[3]利用核磁共振氫譜(1H-NMR)技術建立大鼠尿液的代謝譜，采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)研究各個分組相互間的代謝物譜差異，通過變量重要性投影(VIP)發(fā)現(xiàn)尿液中的潛在生物標志物，通過矯正率篩選姜炭溫經(jīng)止血的藥效生物標志物。結果篩選出與虛寒性出血癥相關的7種生物標志物，其中乙酰乙酸、丙酮酸、氮氧三甲胺、牛磺酸、色氨酸為姜炭溫經(jīng)止血的藥效生物標志物。因此，姜炭溫經(jīng)止血的藥效物質基礎有乙酰乙酸、丙酮酸、氮氧三甲胺、?；撬?、色氨酸。

1.2 川烏

川烏(CW)，一種著名的中藥(TCM)，烏頭Aconitum carmichaelii Debx的母根。Dong[4]等通過UPLC-Q-TOF-HDMS對川烏的毒性進行尿代謝組學研究，結果，鑒定了與CW毒性相關的17種生物標志物，分別為5-羥基-6-甲氧基吲哚葡糖苷酸，4,6-二羥基喹啉，5-L-谷氨酰 -?；撬幔摎湓邢┐纪?，甘氨酸，3-吲哚羧酸葡糖苷酸，3-甲基二氧基吲哚，L-苯丙氨酰-L-羥基黃嘌呤，腺苷琥珀酸，GDP-L-巖藻糖，環(huán)AMP，4-(2-氨基-3-羥基苯基)，4-二氧代丁酸，N-乙?；?9-O-乳酰神經(jīng)氨酸，棕櫚酰葡萄糖醛酸，3-氧代十六烷酸，2-苯乙醇葡糖苷酸和D-葡萄糖醛酸1-磷酸，參與戊糖和葡糖醛酸相互轉化，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，氨基糖和核苷酸糖，嘌呤代謝，色氨酸代謝，?；撬岷蛠喤；撬岽x，果糖和甘露糖代謝，脂肪酸代謝。CG組(川烏：甘草=1：2)，CB組(川烏：白芍=1：2)和CJ組(川烏：干姜=1：2)通過相容性可將大多數(shù)毒性生物標志物的表達水平有效地調節(jié)到正常范圍藥物。研究表明，三種相容性藥物可以有效地對抗CW的毒性。

1.3 黃連

黃連(Coptis chinensis)，別名味連、川連等，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物。根據(jù)現(xiàn)代藥理作用研究，黃連具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及改善糖尿病等藥理作用[5]。王靜等[6]采用對雄性Wistar大鼠灌胃脂肪乳并腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制造Ⅱ型糖尿病模型，大鼠分為正常組、模型組、黃連給藥治療組、二甲雙胍給藥組。大鼠給藥30 d后，采集血樣用于生化指標的檢測，尿樣用于代謝組學的分析。與模型組相比，模型大鼠連續(xù)30 d腹腔注射黃連后，空腹血糖值(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平顯著降低。采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS) 對大鼠尿樣中的內源性物質進行了相對含量測定，主成分分析結果表明，正常組與模型組顯著分離，黃連組處于正常組與模型組之間，更接近于正常組。發(fā)現(xiàn) 12 個代謝物與糖尿病有關，包括 4-甲基苯酚、苯甲酸、氨基丙二酸等。黃連干預后，其中的 7 個代謝物顯著回調，與氧化應激狀態(tài)相關的氨基丙二酸和 L-抗壞血酸出現(xiàn)向正常組顯著性調節(jié)的趨勢。以上結果證實，黃連不僅具有降糖和降血脂的作用，而且具有抗氧化作用，在一定程度上可能會抑制糖尿病合并癥的發(fā)生和發(fā)展。

1.4 人參皂苷

人參皂苷(Ginsenoside)屬于三萜皂苷，是固醇類化合物，主要存在于人參屬藥材中，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗病毒[7]、治療心血管疾病[8]等藥理作用，能夠影響多重代謝通路。謝燮等[9]該研究以Wistar 雄性大鼠為對象，利用代謝組學技術分析其尿液代謝物組成的動態(tài)變化，分析長期服用人參主要有效成分——人參總皂苷對大鼠機體尿液代謝譜的影響。實驗結果表明，服用人參皂苷在1～3 周內對機體尿液的代謝譜影響最大，包括能量代謝、兒茶酚胺類物質以及氨基酸類神經(jīng)遞質代謝，6～10周作用的逐漸減小，27周幾乎無作用，同時證明短期和長期服用人參皂苷對機體無明顯的毒副作用。

1.5 兩色金雞菊

兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又稱“昆侖雪菊”，屬菊科金雞菊屬一年生草本植物。有研究發(fā)現(xiàn)，昆侖雪菊水提液具有降血脂作用，還能夠降低自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠收縮壓而發(fā)揮降血壓的功效[10]。盧偉[11]等本研究工作嘗試建立一種兩色金雞菊醇提物對自發(fā)性高血壓大鼠代謝干預的代謝組學評價方法，采用1H-NMR分析方法測定給藥組和對照組大鼠的尿樣，得到尿樣中小分子代謝物的指紋圖譜，結合主成分分析方法，研究小分子內源性代謝物在金雞菊醇提物灌胃后的變化以及高血壓大鼠尿液代謝物的變化，結果發(fā)現(xiàn)多種代謝產物與高血壓癥密切相關。另外，發(fā)現(xiàn)了與糖代謝相關的代謝物：β-葡萄糖、蘋果酸、丙酮，并且在模型組中均明顯升高，說明高血壓大鼠葡萄糖代謝異常；此外，如膽堿、肌酸酐等小分子物質也被檢測出可能作為高血壓的生物標志物。這些內源性成分的改變提示模型組大鼠尿液存在相關代謝功能的異常，而經(jīng)藥物干預后，以上指標得到一定改善。

2 代謝組學在中藥復方藥效物質基礎中的應用

2.1 芍藥甘草湯

芍藥甘草湯(SGD)，出自漢代張仲景所著《傷寒論》，書中記載了少藥甘草湯的組成，即芍藥與甘草，主要用于治療腹痛和痛經(jīng)。Wang等[12]以Wistar大鼠為研究對象，通過對痛經(jīng)組的模型大鼠和對照組正常大鼠口服芍藥甘草湯后，在肝門靜脈處收集血液，制備血清樣本，建立了高分辨率的UPLC/MS串聯(lián)Waters UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)分析技術，由Waters UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)執(zhí)行梯度洗脫程序，MS/MS裂解行為幫助化合物結構的鑒定，最終表征出芍藥甘草湯的的化學組分和代謝物，結果發(fā)現(xiàn)12種潛在的生物標記物，包括9種原型成分：沒食子酸、白芍苷、甘草苷、刺果甘草素、甘草素、異甘草素、芒柄花黃素、異甘草黃酮醇、甘草利酮、C9H10O3和2種代謝物如甘草素-4’-氧-葡萄糖醛酸苷、芒柄花黃素葡萄糖醛酸，其中3種成分來自芍藥，9種來自甘草，以上在血漿中發(fā)現(xiàn)的成分均是SGD用于治療痛經(jīng)的有效物質，并可能是通過葡萄糖和氨基酸等代謝途徑發(fā)揮作用，為SGD進一步的藥理學和臨床研究提供重要的實驗數(shù)據(jù)。這表明沒食子酸、白芍苷、甘草苷、刺果甘草素、甘草素、異甘草素、芒柄花黃素、異甘草黃酮醇、甘草利酮、C9H10O3和2種代謝物如甘草素-4′-氧-葡萄糖醛酸苷、芒柄花黃素葡萄糖醛酸為芍藥甘草湯的藥效物質基礎。

2.2 當歸四逆湯

當歸四逆湯，出自漢代張仲景的《傷寒論》，現(xiàn)代研究表明，當歸四逆湯有抗凝血、抗炎止痛等作用[13]。采用1H-NMR代謝組學技術，在當歸四逆湯灌胃給藥1周后，觀察當歸四逆湯對小鼠凝血酶時間的影響，并采用1H-NMR 技術分析小鼠血漿代謝物的指紋圖譜，采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，研究給藥組與正常組之間的代謝物組差異，篩選與抗凝血作用相關的潛在生物標志物。代謝組學結果顯示連續(xù)當歸四逆湯灌胃給藥1周后，能顯著延長小鼠凝血酶時間(P<0.05)，且與空白組比較，復方組內源性代謝產物異丁酸、苯丙氨酸和肉堿顯著上調(P<0.01)，組氨酸、賴氨酸和膽固醇顯著下調(P<0.05)。肉堿、苯丙氨酸、組氨酸和膽固醇為當歸四逆湯抗凝過程中潛在代謝標志物，當歸四逆湯可能通過調節(jié)脂質代謝、能量代謝和氨基酸代謝影響血小板聚集功能和組織因子、纖維蛋白酶的表達來發(fā)揮抗凝作用。

2.3 溫心方

溫心方(WXF)由人參、桂枝、薤白、瓜蔞、清半夏、赤芍、麥冬和黃連八種單味藥組成，廣泛用于治療心肌缺血綜合。Cao[14]等采用代謝組學的分析方法，在雄性Wistar大鼠口服溫心方提取物后，從肝門靜脈收集血液，制備血清樣本，通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術，分析溫心方的化學成分和血漿中的代謝產物，在血漿中檢測到32種化學成分，包括溫心方的26種原型化合物和6種代謝產物，可能通過葡萄糖代謝和脂肪酸代謝等途徑而發(fā)揮藥效，為進一步的藥理學研究提供有用的化學信息，提高了生物活性的靶向成分分析速度。

3 討論

藥物代謝組學是藥物代謝與代謝組學結合,也是藥代學與藥效學的結合(PK-PD)[15]。代謝組平臺提供了中草藥、中醫(yī)證候、礦物醫(yī)學和針灸方法來擴展對中醫(yī)藥配方的分析與對其作用機制的理解。由于中藥成分復雜，即使是單味中藥，其中含有多種化學成分，各化學成分都有多種藥理作用。因此，中藥的藥效物質基礎及作用機制的揭示是一個復雜的過程。目前，多數(shù)中藥的作用機制尚不明確，傳統(tǒng)的藥理實驗方法只能在一定程度上揭示中藥的藥理作用機制，而代謝組學不僅能夠研究藥物自身的代謝情況，還能進一步研究藥物干預后內源性代謝物的變化，從而反映出體內生物化學過程和狀態(tài)的變化[16]。如今，代謝組學已成為生物系統(tǒng)中小分子代謝物的綜合表征的熱門話題，它可以通過評估近似生物流體和生物標志物發(fā)現(xiàn)中的全球代謝分布來區(qū)分患病和非患病狀態(tài)信息[17]。近年來，國內外專家對多種中藥藥效作用機制進行的代謝組學研究，取得了有意義的研究結果，研究方向進一步拓展到外源性刺激等更多方面，這樣有利于代謝組學的發(fā)展和延伸[18-21]，為中藥藥效的物質基礎研究奠定了一定的基礎。

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2016-10-15

2016-11-17

國家自然科學基金(81373931，81573877);黑龍江中醫(yī)藥大學創(chuàng)新人才計劃(2012RCD07、2012jc01)

吳修紅(1978-)，女，博士，博士后，教授，主要從事中藥藥效物質基礎及作用機制研究。

*通訊作者：孫暉(1963-)，女，教授，博士生導師，主要從事中藥質量分析研究。

R284

A

1002-2392(2017)01-0087-03