陳建芳，閆 艷，高 靜，于桂霞，周 蕾

(包頭醫(yī)學院病原生物學實驗室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

沙棘籽油對肺孢子蟲肺炎大鼠免疫功能的影響*

陳建芳，閆 艷，高 靜，于桂霞，周 蕾

(包頭醫(yī)學院病原生物學實驗室，內(nèi)蒙古 包頭014060)

目的:探討沙棘籽油對肺孢子蟲肺炎(pneumocystis pneumonia，PCP)大鼠免疫功能的影響，為沙棘籽油的臨床應用提供理論依據(jù)。方法:用地塞米松建立大鼠PCP動物模型，觀察沙棘籽油對其免疫器官指數(shù)的影響，觀察沙棘籽油對其腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響，通過溶血空斑實驗檢測其抗體形成細胞數(shù)量。結(jié)果:沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提高PCP大鼠巨噬細胞的吞噬能力和抗體形成細胞數(shù)量。結(jié)論:沙棘籽油可增強PCP大鼠的免疫功能。

沙棘籽油;肺孢子蟲肺炎;大鼠;免疫功能

肺孢子蟲肺炎(pneumocystis pneumonia，PCP)是免疫缺陷者的常見感染性疾病，多見于艾滋病、器官移植、長期大量應用免疫抑制劑者，其病原體肺孢子蟲在正常宿主體內(nèi)呈隱性感染狀態(tài)，當免疫功能下降或受損時增殖而致病，甚至導致宿主死亡［1］。目前臨床用于治療PCP的主要藥物為復方新諾明、戊烷脒等，雖然療效較好，但某些患者存在嚴重的副作用或耐藥性，因此，尋求新的高效低毒的抗肺孢子蟲藥物成為研究焦點之一。沙棘作為我國傳統(tǒng)中藥，具有高效、生長廣泛、無毒副作用的優(yōu)勢，在治療心血管疾病、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等方面具有廣闊的應用前景［2］。沙棘籽油從沙棘的種子中提取，含有維生素C、維生素E、黃酮、多酚等多種生物活性物質(zhì)，對心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用，還具有抗氧化、抗放射、抗炎、抗過敏等作用［3］。本實驗通過觀察沙棘籽油對PCP大鼠免疫功能的影響，以期為臨床防治PCP提供理論依據(jù)和實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠，體重180～220 g，購自本校實驗動物中心，5只/籠，適應性飼養(yǎng)1周開始試驗，清潔環(huán)境下飼養(yǎng)，喂飼按標準配方配制的普通顆粒飼料，不限制飲水量，7 d更換1次墊料。

1.1.2 主要試劑 沙棘籽油(內(nèi)蒙古宇航人科技有限公司，批號120812);地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州卓峰制藥有限公司產(chǎn)品，批號130217);四環(huán)素(內(nèi)蒙古赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號130301)。

1.2 方法

1.2.1 PCP模型的建立 按參考文獻［4］建立大鼠PCP動物模型。在大鼠腹股溝皮下注射地塞米松磷酸鈉2 mg/次，2次/周，連續(xù)6周，同時在飲水中加入1 mg/mL四環(huán)素以預防繼發(fā)性細菌感染。連續(xù)注射地塞米松磷酸鈉6周后隨機選取2只大鼠處死，制作肺組織印片，用吉姆薩染液染色，鏡檢見肺孢子蟲包囊，證明PCP模型建立成功。實驗過程中，因造模大鼠免疫能力下降，除正常對照組外，PCP模型組和沙棘籽油治療組各死亡2只、沙棘籽油預防組死亡1只。

1.2.2 實驗分組及給藥 隨機分為對照組、PCP模型組、沙棘籽油預防組和沙棘籽油治療組4組，10只/組。除對照組外，其余3組均用地塞米松造模，PCP模型組不給任何治療藥物。沙棘籽油預防組在造模第1周開始，同時用沙棘籽油連續(xù)灌胃6周，1 mL/只，每周3次，連續(xù)6周;沙棘籽油治療組在造模第7周開始用沙棘籽油連續(xù)灌胃1周，2 mL/只，1次/d;其余2組用等量生理鹽水灌胃。各組在試驗第8周采集胸腺、脾臟、血液、腹腔液等標本進行相關(guān)項目檢測。

1.2.3 免疫器官指數(shù)測定 試驗前稱量大鼠體重，在進行腹腔巨噬細胞吞噬試驗的同時，取大鼠的胸腺和脾臟，用濾紙吸干稱重，以胸腺或脾臟重量(mg)與體重(g)之比計算出胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。

1.2.4 腹腔巨噬細胞吞噬功能測定 試驗前3 d向大鼠腹腔注射無菌肉湯2 mL，試驗前向大鼠腹腔注射2%的雞紅細胞懸液1 mL，輕揉腹部。30 min注射Hanks液2 mL，輕揉腹部，脫頸處死大鼠，從腹腔中吸取腹腔液涂片，瑞氏染色后鏡檢，計數(shù)100個巨噬細胞，并計算巨噬細胞吞噬百分率。

1.2.5 抗體形成細胞數(shù)量測定 采用溶血空斑試驗，將大鼠經(jīng)腹腔無菌注射10%綿羊紅細胞懸液1 mL，免疫后4 d脫頸處死大鼠，剖腹取脾，放入加Hanks液平皿內(nèi)，剪碎研磨過濾，制成5×106/mL脾細胞懸液。取脾細胞懸液0.1 mL、補體0.1 mL、20%綿羊紅細胞懸液0.1 mL、Hanks液0.7 mL混勻后加入玻片小室內(nèi)，用凡士林封口。置于37℃溫箱中孵育1～1.5 h。肉眼計數(shù)玻片小室內(nèi)的溶血空斑數(shù)量，即抗體形成細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，以表示，采用單因素方差分析進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 沙棘籽油對大鼠免疫器官指數(shù)的影響 PCP模型組大鼠免疫器官指數(shù)低于對照組(P＜0.05)，提示地塞米松抑制大鼠免疫功能致免疫器官萎縮;與PCP模型組相比，沙棘籽油預防組和治療組大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均升高(P＜0.05);預防組和治療組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。見表1。

表1 沙棘籽油對大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

表1 沙棘籽油對大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)

a為與對照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05

組別 n 胸腺指數(shù)(mg/g) 脾臟指數(shù)(mg/g) 10 0.98±0.11 4.43±0.96 PCP模型組 8 0.45±0.09a 3.01±1.03a沙棘籽油預防組 9 0.92±0.16b 4.23±1.05b沙棘籽油治療組 8 0.80±0.18b 4.07±0.82對照組b

2.2 沙棘籽油對大鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 PCP模型組大鼠腹腔巨噬細胞吞噬率低于對照組(P＜0.05)，提示地塞米松可抑制大鼠巨噬細胞吞噬功能;與PCP模型組相比，沙棘籽油預防組和治療組大鼠腹腔巨噬細胞吞噬率均升高(P＜0.05);預防組和治療組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示沙棘籽油可增強PCP大鼠巨噬細胞吞噬功能。見表2。

表2 沙棘籽油對大鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

表2 沙棘籽油對大鼠巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

a為與對照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05

組別 n 巨噬細胞吞噬百分率(%) 10 51.70±5.48 PCP模型組 8 37.63±3.66a沙棘籽油預防組 9 49.56±6.97b沙棘籽油治療組 8 44.25±4.83對照組b

2.3 沙棘籽油對大鼠抗體形成細胞數(shù)量的影響 PCP模型組大鼠溶血空斑數(shù)量低于對照組(P＜0.05)，提示地塞米松可降低抗體形成細胞數(shù)量;與PCP模型組相比，沙棘籽油預防組和治療組大鼠溶血空斑數(shù)量均增加(P＜0.05);預防組和治療組比較差異有統(tǒng)計學意義，預防組高于治療組(P＜0.05)，提示沙棘籽油可提高大鼠的抗體形成細胞數(shù)量，預防組效果強于治療組。見表3。

表3 沙棘籽油對大鼠抗體形成細胞數(shù)量的影響(±s)

表3 沙棘籽油對大鼠抗體形成細胞數(shù)量的影響(±s)

a為與對照組相比P＜0.05，b為與PCP模型組相比P＜0.05，c為與沙棘籽油預防組相比P＜0.05

組別 n 溶血空斑數(shù)(個/106脾細胞) 10 353.50±65.32 PCP模型組 8 97.50±38.73a沙棘籽油預防組 9 279.44±68.71b沙棘籽油治療組 8 213.13±30.58對照組bc

3 討論

3.1 沙棘籽油能提高大鼠免疫器官指數(shù) 免疫器官是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其發(fā)育情況直接影響機體的免疫功能。通過測定大鼠免疫器官的重量，可初步反映對機體免疫功能的影響［5］。本試驗結(jié)果表明，PCP模型組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)低于對照組，沙棘籽油預防組和治療組大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與PCP模型組相比均升高，說明地塞米松可抑制大鼠免疫器官的發(fā)育，沙棘籽油能增加PCP大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，沙棘籽油可通過對免疫器官的作用起到調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

3.2 沙棘籽油能增強大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能巨噬細胞在體內(nèi)具有非特異性吞噬作用及抗原提呈作用。本試驗試圖探討沙棘籽油對巨噬細胞是否具有免疫促進作用，通過檢測腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞來反映巨噬細胞的吞噬能力。結(jié)果表明，PCP模型組大鼠巨噬細胞吞噬率低于對照組，與PCP模型組相比，沙棘籽油預防組和治療組大鼠巨噬細胞吞噬率均增高，說明地塞米松致大鼠巨噬細胞吞噬功能下降，沙棘籽油能增強大鼠巨噬細胞吞噬功能，提示沙棘籽油具有對巨噬細胞的免疫促進作用，能夠增強機體的非特異性免疫功能。

3.3 沙棘籽油能提高大鼠抗體形成細胞數(shù)量 抗體是體液免疫應答的重要效應分子，與相應的抗原特異性結(jié)合發(fā)揮多種生物學效應。通過溶血空斑試驗檢測脾中抗體形成細胞的數(shù)量，可推算出分泌特異性抗體的B細胞數(shù)量，從而反映機體體液免疫功能狀態(tài)。有研究表明，沙棘提取物可提高小鼠脾臟中抗體生成細胞數(shù)量、提高血清中抗體IgG、IgA、IgM及補體C3、C4水平［6］。本試驗結(jié)果表明，PCP模型組大鼠抗體生成細胞數(shù)量低于對照組，說明地塞米松致大鼠抗體生成細胞數(shù)量降低;與模型對照組相比，沙棘籽油預防組和治療組抗體生成細胞數(shù)量均升高，沙棘籽油對PCP大鼠的預防效果強于治療效果，提示沙棘籽油可提高地塞米松致免疫功能低下大鼠的抗體生成細胞數(shù)量，表明沙棘籽油具有增強機體體液免疫功能的作用。

本研究結(jié)果證明，沙棘籽油可提高PCP大鼠免疫器官指數(shù)，增強其腹腔巨噬細胞的吞噬功能，提高其抗體產(chǎn)生細胞數(shù)量，提示沙棘籽油有增強機體免疫功能的作用，可用于PCP的預防和治療，但其具體作用機制有待進一步的研究。

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2015-09-22)

包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生基金(2011S2012-07-6)