鄭 健，徐 晶，張雪鵬

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北 唐山063000)

缺氧對乳腺癌細(xì)胞miR－210表達(dá)及侵襲能力的影響

鄭 健，徐 晶，張雪鵬

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，河北 唐山063000)

目的:觀察缺氧條件下人乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力的變化，探討缺氧對miR-210表達(dá)的影響及與細(xì)胞侵襲的關(guān)系。方法:實(shí)驗(yàn)分為缺氧組和對照組，缺氧組分別以終濃度為50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的二氯化鈷處理MCF-7細(xì)胞24 h，對照組加等劑量磷酸鹽緩沖液，采用Transwell技術(shù)檢測各組的侵襲能力;根據(jù)Transwell結(jié)果篩選出侵襲力最強(qiáng)的處理組，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR)檢測其與對照組 miR-210的表達(dá)。結(jié)果:Transwell結(jié)果顯示不同終濃度的二氯化鈷處理(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)后乳腺癌MCF-7細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為(168.60±7.50)、(276.73 ±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87±9.51)個/視野，與對照組(65.60±2.58)個/視野相比均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且各缺氧組細(xì)胞的侵襲能力隨缺氧劑加入量的增加逐步增強(qiáng)，呈正相關(guān)性(R=0.978，P=0.000)。RT-PCR結(jié)果顯示200 μmol/L二氯化鈷缺氧組miR-210表達(dá)水平(7.82±1.53)與對照組(1.00)相比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論:人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力隨微環(huán)境缺氧程度的加重而逐步增強(qiáng)，miR-210參與了這一過程。

缺氧;miR-210;乳腺癌;侵襲

乳腺癌已成為當(dāng)前社會的重大公共衛(wèi)生問題，侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。缺氧微環(huán)境普遍存在于多種實(shí)體腫瘤中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在浸潤性乳腺癌，部分乳腺癌細(xì)胞直接生存在缺氧微環(huán)境中。MicroRNAs(miRNAs)長度大多在19-23個核苷酸，可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)來發(fā)揮調(diào)控作用。miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。已有證據(jù)表明，miR-210與缺氧相關(guān)。本研究利用二氯化鈷制作人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的缺氧微環(huán)境，觀察癌細(xì)胞體外侵襲能力的變化，檢測miR-210的表達(dá)，探討miR-210在缺氧條件下與細(xì)胞侵襲的關(guān)系，期待為乳腺癌的臨床治療提供更有價值的幫助。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自上海立菲生物技術(shù)有限公司。胎牛血清購自BI生物科技公司。Transwell小室購自美國康寧生物科技公司。BD基質(zhì)膠購自上海前塵生物公司。Trizol裂解液購自美國Ambion生物公司。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR green試劑盒均購自美國Invitrogen公司，miR-210及其內(nèi)參U6 RNA的引物也由該公司設(shè)計(jì)并合成。miR-210基因逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 引物序列為5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGG ATACGACTCAGC C-3’，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)上游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAG GT-3’，下游引物序列為5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’。U6基因 RT-PCR引物序列為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，PCR上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。二氯化鈷購自美國Sigma公司。二甲基亞砜購自北京百靈威科技有限公司。4%多聚甲醛固定液購自北京Solarbio科技有限公司。

1.2 MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng) 由10%胎牛血清，1%的青霉素-鏈霉素雙抗混合液(10 000 U/mL)及達(dá)爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基(dulbecco＇s minimum essential medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基組成完全培養(yǎng)液，在37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)，每隔1～2 d更換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞90%融合時常規(guī)傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 取70%～80%融合的細(xì)胞，分為缺氧組和對照組。缺氧組分為4個處理組，依次加入含二氯化鈷終濃度為 50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的完全培養(yǎng)液;對照組加入含等劑量磷酸鹽緩沖液的完全培養(yǎng)液，兩組均置于CO2孵箱中濕潤培養(yǎng)24 h，留做Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出侵襲力最強(qiáng)的處理組，與對照組一起重復(fù)之前的處理過程后，留做PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 Transwell上室加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基制備的細(xì)胞懸液(密度為5×105個/mL)，下室加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基500 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出上室，用棉簽輕輕擦去上室未轉(zhuǎn)移細(xì)胞和基質(zhì)膠，切下聚碳酸酯膜，浸入4%多聚甲醛液中固定30 min，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，常規(guī)蘇木素染色，中性樹膠封片。在100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞，每個樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個視野，以穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞總數(shù)為指標(biāo)評價乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，計(jì)算出平均值，每組重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-210基因表達(dá) 使用Trizol提取200 μmol/L二氯化鈷缺氧組和對照組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度與濃度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA完整性，以miR-210為目的基因，以U6 RNA為內(nèi)參照基因，取2 μg濃度和純度符合要求的RNA，采用特異性莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄后，行RT-PCR檢測，體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min; 95℃ 15 s;58℃ 60 s;72℃ 90 s;45個循環(huán)。以2-△△CT(△△CT=△CT缺氧組miRNA-△CT對照組miRNA，△CT=CT miRNA-CT U6 RNA)表示miR-210的相對表達(dá)量。重復(fù)試驗(yàn)步驟至少3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以表示，各組細(xì)胞穿透基底膜數(shù)量比較均采用單因素方差分析(Analysis of single variance，ANOVA)，二氯化鈷濃度與各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿透基底膜數(shù)量的相關(guān)性采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析，兩組乳腺癌細(xì)胞miR-210表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的影響 不同終濃度的二氯化鈷處理組 (50μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(168.60± 7.50)、(276.73±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87± 9.51)個/視野，均高于對照組(65.60±2.58個/視野)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各缺氧組穿膜細(xì)胞數(shù)組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。且伴隨缺氧劑濃度的升高，細(xì)胞侵襲力不斷增強(qiáng)，呈正相關(guān)性(R= 0.978，P=0.000)。在觀測范圍內(nèi)，200 μmol/L二氯化鈷處理組穿膜細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大，見圖1。

2.2 缺氧微環(huán)境中miR-210的表達(dá) 將對照組miR-210的表達(dá)水平定為1.00。同對照組相比，200 μmol/L二氯化鈷缺氧組miR-210的表達(dá)顯著升高，相對表達(dá)量為7.82±1.53，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明特異性的缺氧環(huán)境可以有效的促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-210的表達(dá)，見圖2。

3 討論

缺氧是人類實(shí)體腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖以及腫瘤組織中血管結(jié)構(gòu)的變異都可以引起腫瘤微環(huán)境的缺氧，并且與腫瘤的進(jìn)展有著密切的關(guān)系。二氯化鈷可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)，常被用作缺氧誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)采用二氯化鈷來模擬機(jī)體內(nèi)真實(shí)的缺氧微環(huán)境，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同終濃度的二氯化鈷處理組(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(168.60±7.50)、(276.73±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87±9.51)個/視野，均高于對照組(65.60±2.58)個/視野，且隨缺氧程度的升高，穿膜細(xì)胞數(shù)也逐步增多，表明缺氧微環(huán)境有效的促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的侵襲，且細(xì)胞的侵襲能力會隨著缺氧的加重而逐步增強(qiáng)，本研究進(jìn)一步證實(shí)缺氧可以導(dǎo)致乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，且癌細(xì)胞的侵襲能力與其所處微環(huán)境的缺氧程度二者之間呈正相關(guān)，或至少在一定的缺氧程度范圍內(nèi)是正相關(guān)的。

缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)可能涉及多種分子機(jī)制，而miRNAs是近些年腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，隨著研究的深入有望進(jìn)入臨床成為新的治療靶點(diǎn)。miR-210是一個獨(dú)立的顯著受HIF-1調(diào)控的缺氧型核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分子，低氧引起的miR-210表達(dá)的上調(diào)與腫瘤及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。miR-210與乳腺癌的關(guān)系也很密切，有研究發(fā)現(xiàn)miR-210在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達(dá)明顯升高［1］。還有研究表明，miR -210在三陰性乳腺癌中顯著高表達(dá)，這可能與該類患者易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)［2］。Toyama等［3］的研究也證實(shí)三陰性乳腺癌患者miR-210的高表達(dá)提示預(yù)后不良。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR檢測miR-210的變化顯示，缺氧組miR-210的相對表達(dá)量明顯增高，說明缺氧微環(huán)境可以有效促進(jìn)MCF-7細(xì)胞miR-210的表達(dá)。結(jié)合Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推論，miR-210參與了在缺氧條件下乳腺癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)這一過程。這些研究提示miR-210可以作為乳腺癌細(xì)胞缺氧與否的一種判斷指標(biāo)，進(jìn)而有望應(yīng)用于乳腺癌患者的診斷參考及預(yù)后評判［4］。張楠等［5］的研究也發(fā)現(xiàn)miR-210在乳腺癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-210 inhibitor后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，提示miR-210可能會成為乳腺癌治療的一個新的靶點(diǎn)，而它的抑制劑可能會對乳腺癌的治療產(chǎn)生重要的作用。

［1］ Volinia S，Galasso M，Sana ME，et al.Breast cancer signatures for invasiveness and prognosis defined by deep sequencing of microRNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109 (8):3024-3029.

［2］ Radojicic J，Zaravinos A，Vrekoussis T，et al.MicroRNA expression analysis in triple-negative(ER，PR and Her2/ neu)breast cancer［J］.Cell Cycle，2011，10(3):507-517.

［3］ Toyama T，Kondo N，Endo Y，et al.High Expression of MicroRNA-210 is an Independent Factor Indicating a Poor Prognosis in Japanese Triple-negative Breast Cancer Patients［J］.Jpn J Clin Oncol，2012，42(4):256-263.

［4］ 陳俊青，王曉稼.微小RNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估中的作用［J］.腫瘤學(xué)雜志，2014，20(3):238-243.

［5］ 張楠，李少遊，鞏雅寧，等.miRNA-210對人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2013，20(3):289-294.

Effect of hypoxia on the ability of microRNA-210 in breast cancer cells to express themselves and invade

ZHENG Jian，XU Jing，ZHANG Xuepeng
(Department of Surgical Oncology，The Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan063000，China)

Objective:To observe the changes of the ability of breast cancer MCF-7 cells to invade under the hypoxic condition and explore the effect of hypoxia on the cellular expression of microRNA-210(imiR-210)and its relationship with cell invasion.Methods:MCF-7 cells were divided into the hypoxia group and the control group.Cobalt chloride(CoCl2)with the concentration of 50 μmol/L，100 μmol/L，150 μmol/L and 200 μmol/L was added in different hypoxia groups，and the same volume of phosphate buffered saline(PBS)was added in the control group for 24h.Transwell technique was used to detect the invasive ability of each group.According to Transwell results，the most invasive group was selected to detect the expression of miR-210 by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:Transwell assay showed that the number of cells which penetrated the artificial basement membrane was 168.60±7.50，276.73±9.79，320.27±8.66，516.87 ±9.51/field respectively in different hypoxic groups(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L).Compared with that of the control group(65.60±2.58 cells/field)，the number of penetrating cells in each hypoxic group was significantly increased(P＜0.01)，and the difference was also statistically significant within the hypoxic group(P＜0.01).The invasive ability of cells was increased gradually with the increase of the amount of anoxic agent，which was positively correlated with the increase of the concentration of CoCl2(R=0.978，P=0.000).RTPCR assay showed that the expression level of miR-210(7.82±1.53)in the 200μmol/L CoCl2group was significantly increased compared with that of the control group(1.00，P＜0.01).Conclusion:The invasive ability of human breast cancer MCF-7 cells increases gradually with the increase of the degree of hypoxia，and miR-210 is involved in the process.

Hypoxia;MicroRNA-210;Breast cancer;Invasion

2015-09-22)

張雪鵬