周 軍，王 杰

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

周氏回生丸質量標準提高研究

周 軍，王 杰

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：提高周氏回生丸的質量標準。方法：采用顯微鑒別法對周氏回生丸中的五倍子、雄黃、朱砂進行定性鑒別；采用薄層色譜法對周氏回生丸中的木香、人工麝香、甘草進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定五倍子中沒食子酸的含量，色譜柱為安捷倫ZORBAX TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸(10∶90)，柱溫40 ℃，流速為0.8 ml/min，檢測波長為273 nm。結果：顯微鑒別中五倍子、雄黃、朱砂的顯微特征明顯，薄層色譜中木香、人工麝香、甘草的特征斑點明顯，重現(xiàn)性好，無干擾；沒食子酸在49.6～1 984.0 μg范圍內(nèi)線性關系良好, 五倍子水解前平均回收率為102.0%，RSD為1.30%(n=6)，五倍子水解后平均回收率為99.34%，RSD為1.56%(n=6)。結論：本法專屬性強、準確、快速，使產(chǎn)品的質量得到有效的控制，保證了臨床療效。

周氏回生丸，五倍子，雄黃，朱砂，木香，人工麝香，甘草，顯微鑒別，薄層色譜，沒食子酸，高效液相色譜法

周氏回生丸處方來源于明代紫金錠方加減，最早收載在1978年版《天津市中成藥規(guī)范》、1983年《北京市藥品標準》、1990年版《天津市藥品標準》及衛(wèi)生部《藥品標準中藥成方制劑第十七冊》中；本品為《中國藥典》2010年版一部增訂品種，同時亦為國家藥品標準提高行動計劃中成藥品種增修訂品種。根據(jù)國家藥品標準提高行動計劃中成藥品種增修訂項目任務表的要求，對周氏回生丸質量標準進行了提高、完善，增加處方中五倍子、雄黃和朱砂的顯微鑒別方法，增加了木香、甘草及人工麝香的薄層鑒別方法，并制定了五倍子的含量測定方法。修訂后的質量標準提高了藥品的質量控制指標，具有專屬性強、準確度高的特點，現(xiàn)該標準已收錄在《中國藥典》2010年版一部及《中國藥典》2015年版一部。

1 實驗材料

1.1 儀器 島津LC-2010C高效液相色譜儀，配有四元泵、紫外檢測器、自動進樣器、柱溫箱、CLASS-VP工作站。METTLER TOLEDO AG135型電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團生產(chǎn))；CAMAG薄層色譜成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司生產(chǎn))；薄層色譜用硅膠G板(煙臺市化學工業(yè)研究所生產(chǎn))。

1.2 試藥 木香對照藥材(批號120921-200502)、甘草對照藥材(批號120904-200511)、麝香酮對照品(批號110719-200512)、沒食子酸對照品(批號110831-200302，供含量測定用)，均于中國藥品生物制品檢定所購置。甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)，鹽酸、磷酸均為分析純，水為去離子水。周氏回生丸樣品由天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠(批號0805001，0805002，0805003)、北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號8040542)提供。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 鑒于本品為生粉入藥，采用顯微鑒別法對處方中五倍子、雄黃和朱砂進行鑒別，參照《中國藥典》有關內(nèi)容，制定了周氏回生丸顯微鑒別標準。具體內(nèi)容為：非腺毛1至數(shù)個細胞，有的頂端稍彎曲(五倍子)；不規(guī)則碎塊金黃色或橙黃色，有光澤(雄黃)；不規(guī)則細小顆粒暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑色(朱砂)。經(jīng)檢驗，四批樣品均具有周氏回生丸的顯微特征，符合規(guī)定。結果見圖1。

圖1 五倍子的非腺毛(A、B) 雄黃的不規(guī)則碎塊(C)朱砂的不規(guī)則細小顆粒(D)顯微鑒別圖譜

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 木香的TLC鑒別 取本品適量，研細，取10 g，加50%甲醇60 ml，超聲處理30 min，離心，取上清液，加石油醚(30～60 ℃)提取2次，每次20 ml,合并石油醚液，揮干溶劑，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液[1，2]。另取木香對照藥材0.25 g，加乙醚20 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯2 ml使溶解，作為對照藥材溶液。按處方配比，取處方藥材10 g(木香除外)按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗，吸取供試品溶液4～10 μl、對照藥材溶液2 μl、陰性對照溶液10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-丙酮(6.5∶3.5∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果供試品色譜中在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品色譜在相應位置無干擾，見圖2。

1.木香對照藥材 2.樣品1(批號0805001) 3.樣品2(批號0805002) 4. 樣品3(批號0805003) 5.樣品4(批號8040542) 6.陰性樣品

2.2.2 人工麝香的TLC鑒別

2.2.2.1 先加顯色劑的方法 取“2.2.1”項下木香供試品溶液加入二硝基苯肼乙醇試液1 ml，置具塞試管中40 ℃溫浸30 min，放冷，作為供試品溶液。另取麝香酮對照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2 mg的溶液，取1 ml，加二硝基苯肼乙醇試液1 ml，40 ℃溫浸30 min，放冷，作為對照品溶液。再按處方配比，取處方藥材10 g(人工麝香除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗，吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl、對照品溶液4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-二氯甲烷(2∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性樣品色譜在相應位置無干擾，見圖3。

2.2.2.2 后噴顯色劑的方法 取“2.2.1”項下木香供試品溶液作為供試品溶液。另取麝香酮對照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含2 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方配比，取處方藥材10 g(人工麝香除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗，吸取供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl、對照品溶液4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-二氯甲烷(2∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性樣品色譜在相應位置無干擾，見圖3。

先加顯色劑 后噴顯色劑

2.2.3 甘草的TLC鑒別 取“2.2.1”木香鑒別項下石油醚提取后的50%甲醇溶液，蒸干，殘渣加水15 ml使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液[3]。另取甘草對照藥材0.5 g，加50%甲醇溶液25 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 ml使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。再按處方配比，取處方藥材10 g(甘草除外)，按制法制得陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。按照《中國藥典》2010年版一部TLC法試驗，吸取供試品溶液2～6 μl、對照藥材溶液4 μl、陰性對照溶液6 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(14∶7∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，分別顯相同顏色的斑點及熒光斑點，陰性對照溶液無干擾。結果見圖4。

日光 UV(365 nm)

1.甘草對照藥材 2.樣品1(批號0805001) 3.樣品2(批號0805002) 4.樣品3(批號0805003) 5.樣品4(批號8040542) 6.陰性樣品溶液

圖4 甘草薄層色譜圖

3 沒食子酸的測定

3.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(10∶90)；柱溫：40 ℃；流速：0.8 ml/min；檢測波長：273 nm。理論板數(shù)按沒食子酸峰計算不低于5 000。

3.2 溶液的制備及專屬性試驗

3.2.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 ml含沒食子酸30 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(0805001)樣品適量，研細，取0.5 g，精密稱定，精密加入50%甲醇溶液50 ml，稱定重量，置水浴中加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，離心，取上清液作為測定游離沒食子酸的供試品溶液；再精密量取上清液5 ml，置圓底燒瓶中，減壓蒸干，加入鹽酸溶液(36→100) 15 ml，置沸水浴中加熱2 h，放冷，轉移至50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為測定總沒食子酸供試品溶液。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方取除五倍子的各味藥材，按制法制得陰性樣品，再按“3.2.2”項下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

3.2.4 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液10 μl、供試品溶液5 μl與陰性樣品溶液5 μl，注入液相色譜儀，測定，結果陰性樣品無干擾，見圖5。

3.3 標準曲線的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1 ml中含沒食子酸4.96、9.92、19.84、39.68、99.20和198.40 μg的對照品溶液，分別精密吸取各10 μl，注入液相色譜儀，按“3.1”項下色譜條件分析，分別測定各自峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程：Y=3 758X+12 438(r=0.999 9)。結果表明沒食子酸在49.6～1 984.0 μg范圍內(nèi)線性良好。

1.沒食子酸

3.4 精密度試驗 取同一批號樣品(0805001)適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，水解前樣品中沒食子酸峰面積平均值為1 709 347.7，RSD為0.11%；水解后樣品中沒食子酸峰面積平均值為1 587 674.3，RSD為0.16%。

3.5 重復性試驗 取同一批號樣品(0805001)適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，共6份，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.1”項下色譜條件分析，測定，水解前樣品中沒食子酸含量平均值為8.887 1 mg/g，RSD為0.49%；水解后樣品中沒食子酸含量平均值為81.792 1 mg/g，RSD為0.93%。

3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(0805001)適量，取約0.5 g，精密稱定，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18和24 h進樣，測定，水解前樣品中沒食子酸峰面積平均值為17 21 419.9，RSD為0.88%；水解后樣品中沒食子酸峰面積平均值為1 569 602.9，RSD為1.18%，表明兩種供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 加樣回收率試驗

3.7.1 水解前樣品加樣回收率 取同一批號樣品(0805001)適量，取約0.25 g，精密稱定，共6份，分別精密加入每1 ml中含55.58 μg的沒食子酸對照品的50%甲醇溶液50 ml，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，至“離心，取上清液”，過微孔濾膜，制得供回收率用供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件分析，計算回收率，結果水解前沒食子酸平均回收率為102.0%，RSD為1.30%。結果見表1。

3.7.2 水解后樣品加樣回收率 取同一批號樣品(0805001)適量，取約0.25 g，精密稱定，共6份，分別精密加入每1 ml中含408.62 μg的沒食子酸對照品的50%甲醇溶液50 ml，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件分析。計算回收率，結果沒食子酸平均回收率為99.34%，RSD為1.56%。結果見表2。

表1 水解前沒食子酸加樣回收率試驗結果(n=6)

表2 水解后沒食子酸加樣回收率試驗結果(n=6)

3.8 樣品測定 取2個廠家4個批號的樣品，按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作，按“3.1”項下色譜條件分析,測定，計算樣品中沒食子酸含量。結果見表3。

表3 4批樣品含量測定結果

4 討論

4.1 麝香酮采用二硝基苯肼乙醇試液顯色顯黃色，但是薄層板背景顏色也同樣顯黃色(見圖3)，影響斑點檢視效果。試驗中采用先加顯色劑并加溫反應后，再點樣、展開的方式，結果消除了薄層板背景干擾現(xiàn)象，結果滿意。

4.2 五倍子中主含五倍子鞣質，含量為60%～70%，五倍子鞣質是由葡萄糖與沒食子酸結合所成，同時亦含游離的沒食子酸，含量占2%～4%。五倍子鞣質具有斂肺、澀腸、止血、解毒功效。因此，起草標準采用高效液相色譜法，分別對樣品中游離的沒食子酸與總沒食子酸進行了測定。

4.3 樣品水解方式的考查 取同一50%甲醇加熱回流提取后的樣品溶液，其中兩份樣品溶液減壓蒸干，其余兩份樣品保留，分別加入鹽酸溶液(36→100)20 ml，置沸水浴中加熱回流2 h，放冷，轉移至50 ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。結果減壓蒸干的樣品水解后，樣品中總沒食子酸含量較高，因此樣品應減壓蒸干后再加鹽酸水解。原因分析：甲醇的沸點為64.5 ℃，如果樣品溶液中含有甲醇，在水浴中加熱時會首先沸騰、蒸發(fā)、冷凝，導致樣品溶液實際水解溫度降低，引起樣品中的沒食子酸含量低于實際結果，見表4。

表4 水解方式的考查(n=2)

4.4 色譜條件的選擇 《中國藥典》2005年版一部五倍子含量測定采用的流動相為甲醇-0.1%磷酸(15∶85)，經(jīng)試驗，此流動相沒食子酸色譜峰出峰較快，因此將流動相比例調(diào)整為甲醇-0.1%磷酸(10∶90)[4，5]。

1 高詠莉.木香理氣片的質量標準研究[J].天津藥學,2007,19(4):18-19

2 周軍，張晶，金兆祥，等.濟坤丸質量標準研究[J].天津藥學,2010,22(1):28-30

3 蘇海萍.咽炎糖漿的制備及質量控制[J].天津藥學,2004,16(3):14-15

4 夏清，劉圓，李瑩，等.RP-HPLC測定鬼針草屬藥材中的沒食子酸[J].華西藥學雜志,2009,24(3):308-310

5 中國藥典[S].一部.2005:45-46

2016-01-26

R927

A

1006-5687(2016)02-0004-04