孫永芳 ， 徐 璐 ， 張乾義 ， 王 琴

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

豬瘟病毒抗原表位的研究進(jìn)展

孫永芳 ， 徐 璐 ， 張乾義 ， 王 琴

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

豬瘟病毒(CSFV)是黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，病毒核酸長約為12.3 kb，由5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)、一個開放閱讀框(ORF)和3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)構(gòu)成，開放閱讀框編碼 3 898 個氨基酸的前體蛋白，在合成過程中被病毒自身編碼的或宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶水解為4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，迄今為止發(fā)現(xiàn)與抗原相關(guān)的蛋白有3種，分別為結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3。CSFV的主要抗原表位主要分布于結(jié)構(gòu)蛋白Erns、E2，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；已有研究發(fā)現(xiàn)[1]，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3也是一種抗原相關(guān)蛋白，能夠誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，且在病毒復(fù)制及病毒與宿主細(xì)胞相互作用中扮演了十分重要的角色。

抗原并不是通過完整的分子來發(fā)揮作用的，其功能和特異性往往是通過其抗原表位來實(shí)現(xiàn)的，免疫細(xì)胞通過識別與結(jié)合抗原分子上的抗原表位來啟動免疫應(yīng)答，CSFV抗原相關(guān)蛋白中含有多種表位，其中包括與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，激活淋巴細(xì)胞從而引起免疫反應(yīng)，也包括與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)，因此研究CSFV抗原表位對明確病毒的免疫機(jī)制、致病機(jī)理以及疫苗的設(shè)計具有重要的意義。本文就上述3種相關(guān)蛋白表位的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，同時對其在疾病診斷、疫苗研發(fā)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了闡述。

1 E2蛋白表位

CSFV E2蛋白位于病毒的囊膜表面，由ORF編碼的690(Arg)至1 060(Leu)之間的370個氨基酸殘基組成，分子量為51-58 kD，主要以同源二聚體或與E2-E1的異源二聚體形式存在于細(xì)胞或病毒粒子表面，靠近E2蛋白N端上游有一段信號肽序列，C端有一段約40個疏水性氨基酸構(gòu)成的跨膜區(qū)(TMR)。在CSFV編碼的蛋白中，E2是最不保守的一種蛋白，但卻是主要的抗原蛋白，參與病毒的感染過程并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。E2蛋白作為CSFV主要保護(hù)性抗原，因此大量的表位研究也主要集中在CSFV E2基因上。從1989年Wensvoort等[2]就開始利用制備的13株CSFV特異性單克隆抗體完成了E2蛋白抗原結(jié)構(gòu)域的劃分，發(fā)現(xiàn)了4個獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域：A、B、C、D。后經(jīng)van Rijn[3]對E2抗原結(jié)構(gòu)模型的進(jìn)行預(yù)測，確定了這4個區(qū)域的位置，發(fā)現(xiàn)這些抗原結(jié)構(gòu)域主要位于E2蛋白近N端的1/2部分，處于兩個相對獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單位，一個由結(jié)構(gòu)域B和C組成，另一個由高度保守的A構(gòu)成。2000年Lin等[4]對CSFV Alfort株E2蛋白部分N端(690aa～910aa)進(jìn)行融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與單抗WH303進(jìn)行識別鑒定，確定了一個高度保守的線性表位(829aa～837aa：TAVSPTTLR)，比對發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在CSFV中高度保守，存在于所有CSFV毒株中，但在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和羊邊界病毒(BDV)則變異較大，目前已有許多研究者應(yīng)用該表位進(jìn)行的疫苗研究[27-30]。劉思國等[5]從氨基酸的抗原性、親水性和表面可及性等方面應(yīng)用蛋白分析軟件，對CSFV疫苗株E2蛋白抗原表位進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)合E2蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，人工合成兩條多肽序列，與多種特異性單抗進(jìn)行反應(yīng)以及偶聯(lián)載體后免疫家兔，發(fā)現(xiàn)多肽WKEYNHDLQND(719aa～730aa)具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性，并推測該表位可能是B細(xì)胞構(gòu)象型表位。隨著噬菌體肽庫的發(fā)展，Yu等[6]利用酵母表達(dá)的重組CSFV E2蛋白制備單抗，通過篩選靶基因表達(dá)文庫和噬菌體展示隨機(jī)肽庫，在E2蛋白C端發(fā)現(xiàn)一個瘟病毒屬保守性的線性表位YYEP(995aa～998aa)，Dong等[7]通過構(gòu)建表位肽疫苗，通過動物實(shí)驗也證實(shí)了KNKYYEP(992aa～998aa)是CSFV石門株E2蛋白的一個抗原表位。肖昌等[8]利用抗E2蛋白單抗A11淘選噬菌體隨機(jī)12肽庫，發(fā)現(xiàn)單抗A11識別抗原表位為TTWKEYSH(717aa～724aa)，位于E2蛋白的N端。Peng等[9]利用單抗HQ06進(jìn)行淘選噬菌體隨機(jī)12肽庫，發(fā)現(xiàn)LFDGTNP(772aa～778aa)是E2蛋白的一個線性B細(xì)胞表位。徐和敏等[10]構(gòu)建CSFV石門株和疫苗株E2基因噬菌體展示多肽庫，利用7株單抗進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有3個表位存在高度同源性，其中TAVSPTTLR已經(jīng)證實(shí)為E2蛋白的抗原表位，GGQ(V)VK(887aa～891aa)和PDGLPHY(903aa～909aa)與預(yù)測表位一致，推測可能是E2蛋白的潛在抗原表位。目前本實(shí)驗室應(yīng)用肽芯片高通量篩選法鑒定特異性單抗的抗原表位，發(fā)現(xiàn)篩選結(jié)果與徐和敏篩選表位部分重疊，對其表位的精確定位正在進(jìn)一步鑒定之中。

為了進(jìn)一步了解E2蛋白的構(gòu)象表位，確定特殊氨基酸在抗原表位中的作用，van Rijn等[11-12]用點(diǎn)突變的方法將CSFV E2蛋白N端6個半胱氨酸(Cys)替換為絲氨酸(Ser)，利用多種特異性單抗進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)第693和737位Cys對E2蛋白B和C結(jié)構(gòu)域抗原表位是必需的，第792、818位和856位Cys對A和D區(qū)域的抗原表位是必需的。Chang等[13]對CSFV E2蛋白結(jié)構(gòu)域中所有Cys進(jìn)行了定點(diǎn)突變，構(gòu)建載體進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CSFV E2蛋白的D/A結(jié)構(gòu)域和C端末端分別存在一個構(gòu)象表位，而且D/A區(qū)域中的Cys不僅影響與抗D/A區(qū)單抗的結(jié)合，還對抗C端蛋白的單抗結(jié)合有影響，說明這兩個表位之間在空間構(gòu)象上相鄰且相互作用。

2 Erns蛋白表位

Erns糖蛋白是由ORF編碼的268(Glu)至494(Ala)之間的227個氨基酸組成，存在9個潛在的糖基化位點(diǎn)，分子量為44～48 kD， Erns沒有疏水的跨膜區(qū)，通過非共價連接方式與病毒囊膜中的E2-E1二聚體蛋白或以疏水作用力與囊膜脂質(zhì)層結(jié)合在病毒粒子表面[14]，在病毒囊膜上不穩(wěn)定，是可分泌蛋白，在CSFV感染的細(xì)胞上清、組織和血清中均能檢測到Erns蛋白。Erns作為CSFV的免疫糖蛋白，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，被用于抗原表位載體的研究。Langeduk等[15]在CSFV Erns蛋白C端191aa～227aa處發(fā)現(xiàn)了一個抗原表位，該表位具有鑒別CSFV、BVDV、BDV的功能，利用該多肽可以對免疫豬和自然感染豬進(jìn)行鑒別診斷，王鈺璇等[16]通過原核表達(dá)也證實(shí)了該段多肽具有良好的抗原特異性。Lin等[17]通過對CSFV Alort/187株的Erns蛋白進(jìn)行分段表達(dá)，發(fā)現(xiàn)位于332aa～412aa、351aa～427aa和376aa～487aa三個重疊區(qū)域能夠與抗CSFV全血清發(fā)生反應(yīng)，說明這3個區(qū)間中存在抗原表位，且涵蓋了病毒的保守區(qū)和變異區(qū)。Meyer等[18]采用點(diǎn)突變和構(gòu)建重疊Erns肽庫的方法，利用抗Erns的單抗篩選表位，發(fā)現(xiàn)在CSFV Alfort/187株的一個抗原區(qū)域存在3個模擬表位，分別為TNYTCCKLQ(64aa～72aa)，RHEWNKHGW(73aa～81aa)，DPWIQLMNR(88aa～96aa)。到目前為止，人們對Erns蛋白的抗原表位研究較少，這是由于Erns蛋白雖然是一個比較保守的蛋白，但其暴露在囊膜外的部分為易變區(qū)，因此Erns抗原表位的差異性較大，沒有發(fā)現(xiàn)一株抗Erns的單抗能夠識別所有的毒株，這為其研究增加了困難。

3 NS3蛋白表位

在不同瘟病毒之間以及同一瘟病毒的不同毒株之間，NS2/3裂解位點(diǎn)的切割程度變化很大，在CSFV中NS2/3呈不完全切割，出現(xiàn)NS2-3和NS3兩種形式，研究發(fā)現(xiàn)，NS2-3是一種免疫優(yōu)勢蛋白[19]，在感染動物體能均能發(fā)現(xiàn)抗NS2-3的抗體，但NS2-3抗體不具有病毒中和活性。已有研究發(fā)現(xiàn)[20]，在CSFV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與NS4A酶切位點(diǎn)附近(2 273aa～2 287aa)存在一個MCH-Ⅰ分子的T細(xì)胞表位(ENALLVALF)，該表位能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而且該表位在瘟病毒屬中高度保守。此后，Armemgol等[21]在NS2-3上也鑒定了一個T細(xì)胞表位，采用人工合成多肽的方法，橫跨CSFV 82%的氨基酸序列，進(jìn)行誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有一段肽段(KHKVRNEVMVHWFDD)與CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3 1 446～1 460位氨基酸殘基同源，而且該多肽可以誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子-γ(Interferon Regulatory Factor -γ，INF-γ)分泌，INF2-γ能夠刺激CD+4T和CD+8T 細(xì)胞應(yīng)答，在融細(xì)胞試驗中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CSFV特異性T淋巴細(xì)胞能夠融解含有該多肽的靶細(xì)胞，這說明該肽段上既存在CSFV特異的輔助性T細(xì)胞抗原表位，又含有CTL抗原表位，該表位可作為合成肽疫苗的候選區(qū)域，在黃病毒科其他病毒的表位研究中，也發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3上存在T細(xì)胞表位，這與CSFV結(jié)果一致[22-24]，這為深入了解CSFV NS3蛋白抗原表位提供了依據(jù)，也為CSFV新型疫苗的研制提供思路。

4 豬瘟病毒抗原表位的應(yīng)用

抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，研究抗原表位對設(shè)計具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子以及新型診斷試劑等具有重要意義，隨著抗原表位鑒定技術(shù)以及預(yù)測方法的不斷更新與完善，研究者對CSFV抗原表位研究也逐步深入，使得將表位應(yīng)用到疫苗研究、病毒診斷以及鑒定特異性抗體等方面成為可能。

4.1 檢測診斷 抗原表位是激發(fā)免疫反應(yīng)的基本單元，使用特異性的抗原表位或其復(fù)合物作為抗體或細(xì)胞因子的檢測物，可檢測出特異的免疫成分，提高診斷的特異性，而且使用多種特異表位作為檢測抗原也可提高診斷方法的敏感性，目前已有許多研究者制備特異性的單抗用于抗原或抗體的檢測，而且成果顯著。張富強(qiáng)等[25]基于單抗、抗原表位的特異性和噬菌體模擬表位的放大效應(yīng)，以單抗作為包被抗體，以噬菌體模擬表位為競爭指示劑，以抗M13噬菌體主要蛋白的特異性抗體為檢測抗體，建立了用于CSFV抗原檢測的競爭ELISA，在76份臨床樣品檢測中，該方法較國際標(biāo)準(zhǔn)抗原捕捉ELISA具有更高的敏感性，可作為CSFV抗原常規(guī)檢測方法應(yīng)用。Li等[26]使用pET表達(dá)系統(tǒng)將CSFV E2蛋白部分抗原表位和Erns蛋白部分抗原表位作為嵌合蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，制備豬瘟抗體膠體金快速檢測試紙，用該試紙對免疫后豬血清進(jìn)行抗體檢測，其敏感度為97.0%(65/67),特異性為100%(98/98)，這與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果相一致，符合率達(dá)93.5%，制備的試紙條能夠快速檢測免疫CSFV疫苗后豬體內(nèi)的抗體效價，具有一定的應(yīng)用價值。Fimme等[27]利用多肽懸浮芯片技術(shù)，將CSFV E2蛋白線性表位(TAVSPTTLR)固定在磁珠上，從而來捕捉血清中特異性抗體，使用該方法對87份CSFV陽性血清以及BVDV和BDV陽性血清進(jìn)行反應(yīng)，確定含有特異表位的芯片能夠與CSFV血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與其他瘟病毒屬進(jìn)行交叉反應(yīng)，該方法可用于豬瘟病毒與其他瘟病毒之間的鑒別檢測。

4.2 疫苗研究 到目前為止，豬瘟兔化弱毒疫苗接種仍然是控制豬瘟的主要手段，但其惟一的缺陷是無法區(qū)分感染動物與免疫動物。隨著豬瘟根除計劃的推進(jìn)，許多研究者開始致力于新型豬瘟疫苗的研制。研究者利用保守抗原表位TAVSPTTLR進(jìn)行了一系列的疫苗研究，將該表位與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)[28]或人工合成表位肽并結(jié)合載體蛋白[29]來提高表位肽疫苗的免疫原性，免疫動物后均能產(chǎn)生特異性的中和抗體，但不能對動物產(chǎn)生完全保護(hù)。此后，Monso[30]和Guo等[31]構(gòu)建CSFV多表位分枝多肽系統(tǒng)，將E2蛋白的B細(xì)胞表位和NS3蛋白的T細(xì)胞表位共同連接到一個賴氨酸“樹”上形成樹狀分枝結(jié)構(gòu)，使免疫原性有所提高，但仍不能產(chǎn)生完全保護(hù)。Holinka等[32,33]通過轉(zhuǎn)座子篩選方法在CSFV Brescia株E1基因中插入Flag片段使病毒致弱，并以Flag為陽性標(biāo)記，突變單抗WH303對應(yīng)表位(TAVSPTTLR)為陰性標(biāo)記，動物實(shí)驗結(jié)果顯示，免疫該標(biāo)記疫苗后，豬體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的抗Flag抗體，而改造后疫苗免疫后不產(chǎn)生與TAVSPTTLR表位相應(yīng)的抗體，并保護(hù)豬免受豬瘟強(qiáng)毒的感染，這說明該毒株是一種具有潛力的雙標(biāo)記疫苗，可用于豬瘟病毒的預(yù)防和檢測。

4.3 其他應(yīng)用 病毒載體疫苗利用載體容量大的特性，可以研制多聯(lián)疫苗，實(shí)現(xiàn)一針防多病的目的，是新型豬瘟疫苗的主要研究方向，目前用于豬瘟疫苗研究的載體主要包括痘病毒、偽狂犬病病毒、豬腺病毒和牛流行性腹瀉病毒等載體，應(yīng)用這些載體已成功研制出一些疫苗，但往往出現(xiàn)免疫效果不理想，免疫應(yīng)答遲緩，存在潛在的基因交換的風(fēng)險等問題，因此研究人員仍在繼續(xù)尋找合適的載體用于疫苗的研究，Zhu等[34]分別將PRRSV全部ORF5和CSFV E2蛋白部分抗原表位插入到致弱的腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisviruses，EMCV)中，構(gòu)建重組病毒，其表達(dá)產(chǎn)物是部分PRRSV囊膜蛋白GP5和CSFV中和抗原表位與EMCV蛋白相連，免疫小鼠檢測產(chǎn)物的免疫原性，發(fā)現(xiàn)小鼠可以產(chǎn)生抗PRRSV或抗CSFV的中和抗體，這說明EMCV可以作為一個表達(dá)載體或工具用于新型疫苗的研究。Zhang等[35]利用將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcinecircovirustype2，PCV-2)核心蛋白核定位信號(nuclear location signal，NLS)替換成外源蛋白而形成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，分別將CSFV T細(xì)胞表位(1 446aa～1 460aa)、B細(xì)胞表位(693aa～716aa)和兩表位相連進(jìn)行替換，，對重組基因進(jìn)行桿狀病毒表達(dá)，間接ELISA和Western-Blot驗證抗原表位，免疫小鼠進(jìn)行免疫原性評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種模擬核心蛋白NLS形成VLPs，并且誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的抗PCV-2和抗CSFV的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而推測PCV-2 VLPs可用于抗原載體來傳遞外源表位，并且可制備成多價苗用于新型疫苗的研究。

5 小結(jié)

抗原表位作為抗原的重要組成部分，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，而表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息，為進(jìn)一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，而且對藥物合成、疫苗設(shè)計等具有指導(dǎo)意義。近年來，研究者致力于CSFV抗原表位的研究，篩選出多個特異性CSFV表位，這使得為豬瘟疫苗的研發(fā)與診斷鑒定提供了理論依據(jù)。文章針對近年來CSFV抗原相關(guān)蛋白中抗原表位的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述，并對其在疾病診斷、疫苗研發(fā)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，為研究學(xué)者深入了解CSFV免疫機(jī)理、致病機(jī)理及疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)，具有一定的參考價值。

[1] 查云峰. 豬瘟病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)及反應(yīng)原性研究[D]. 長春：吉林大學(xué), 2005.

[2] Wensvoort G, Terpstra C, Kluijver E P D,etal. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus[J]. Veterinary Microbiology, 1989, 21(1):9.

[3] van Rijn P A, van Gennip R G, de Meijer E J,etal. A preliminary map of epitopes on envelope glycoprotein E1 of HCV strain Brescia[J]. Veterinary Microbiology, 1992, 33(1-4):221.

[4] Lin M, Lin F, Mallory M,etal. Deletions of structural glycoprotein E2 of classical swine fever virus strain alfort/187 resolve a linear epitope of monoclonal antibody WH303 and the minimal N-terminal domain essential for binding immunoglobulin G antibodies of a pig hyperimmune serum[J]. Journal of Virology, 2000, 74(24):11 619-11 625.

[5] 劉思國, 馬剛, 余興龍,等. 豬瘟病毒E2糖蛋白抗原表位的預(yù)測、多肽合成及特性研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2004, 20(07):448-450.

[6] Yu M, Wang L F, Shiell B J,etal. Fine Mapping of a C-Terminal Linear Epitope Highly Conserved among the Major Envelope Glycoprotein E2 (gp51 to gp54) of Different Pestiviruses[J]. Virology, 1996, 222(1):289-292.

[7] Dong X N, Wei K, Liu Z Q,etal. Candidate peptide vaccine induced protection against classical swine fever virus.[J]. Vaccine, 2002, 21(3-4):167.

[8] 肖昌, 余興龍, 張茂林,等. 利用隨機(jī)肽庫鑒定豬瘟病毒E2蛋白抗原表位[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2005, 25(5):449-453.

[9] Peng W P, Hou Q, Xia Z H,etal. Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fever virus by phage-displayed random peptide library[J]. Virus Research, 2008, 135(2):267-272.

[10] 徐和敏, 王琴, 徐璐,等. 豬瘟病毒E2基因噬菌體展示多肽庫的構(gòu)建及表位鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2010, 41(01):71-76.

[11] van Rijn P A, van Gennip H G, de Meijer E J,etal. Epitope mapping of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus strain Brescia.[J]. Journal of General Virology, 1993, 74 ( Pt 10)(10):2 053-2 060.

[12] v an Rijn P A, Miedema G K, Wensvoort G,etal. Antigenic structure of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus.[J]. Journal of Virology, 1994, 68(6):3 934-3 942.

[13] Chang C Y, Huang C C, Deng M C,etal. Identification of conformational epitopes and antigen-specific residues at the D/A domains and the extramembrane C-terminal region of E2 glycoprotein of classical swine fever virus[J]. Virus Research, 2012, 168(1-2):56-63.

[14] Rümenapf T, Unger G, Strauss J H,etal. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses[J]. Journal of Virology, 1993, 67(6):3 288-3 294.

[15] Langedijk J P, Middel W G, Meloen R H,etal. Enzyme-linked immunosorbent assay using a virus type-specific peptide based on a subdomain of envelope protein E(rns) for serologic diagnosis of pestivirus infections in swine[J]. 2001, 39(3):906-912.

[16] 王鈺璇, 姚鳳, 伏小平,等. 豬瘟病毒E0蛋白的表達(dá)與抗原性研究[J]. 中國動物檢疫, 2007, 24(8):29-31.

[17] Lin M, Trottier E, Pasick J,etal. Identification of antigenic regions of the Erns protein for pig antibodies elicited during classical swine fever virus infection[J]. Journal of Biochemistry, 2004, 136(6):795.

[18] Meyer D, Aebischer A, Müller M,etal. New insights into the antigenic structure of the glycoprotein E(rns) of classical swine fever virus by epitope mapping[J]. Virology, 2012, 433(1):45-54.

[19] Tang Q H, Zhang Y M, Xu Y Z,etal. Up-regulation of integrin β3 expression in porcine vascular endothelial cells cultured in vitro by classical swine fever virus[J]. Veterinary Immunology & Immunopathology, 2010, 133(2-4):237-242.

[20] Pauly T, Elbers K, K?nig M,etal. Classical swine fever virus-specific cytotoxic T lymphocytes and identification of a T cell epitope[J]. Journal of General Virology, 1995, 76 ( Pt 12)(12):3 039-3 049.

[21] Armengol E, Wiesmüller K H, Wienhold D,etal. Identification of T-cell epitopes in the structural and non-structural proteins of classical swine fever virus[J]. 2002, 83(Pt 3):551-560.

[22] Erickson A L, Houghton M, Choo Q L,etal. Hepatitis C virus-specific CTL responses in the liver of chimpanzees with acute and chronic hepatitis C[J]. Journal of Immunology, 1993, 151(8):4 189-4 199.

[23] Kurane I, Brinton M A, Samson A L,etal. Dengue virus-specific, human CD4+ CD8- cytotoxic T-cell clones: multiple patterns of virus cross-reactivity recognized by NS3-specific T-cell clones.[J]. Journal of Virology, 1991, 65(4):1 823-1 828.

[24] Lobigs M, Arthur C E, Müllbacher A,etal. The Flavivirus Nonstructural Protein NS3 Is a Dominant Source of Cytotoxic T Cell Peptide Determinants[J]. Virology, 1994, 202(1):195-201.

[25] 張富強(qiáng), 李志華, 張念祖. 競爭性ELISA檢測豬瘟病毒抗原[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2005, 41(11):9-12.

[26] Li X, Wang L, Shi X,etal. Development of an immunochromatographic strip for rapid detection of antibodies against classical swine fever virus[J]. Journal of Virological Methods, 2012, 180(1-2):32.

[27] Wal F J V D, Jelsma T, Fijten H,etal. Towards a peptide-based suspension array for the detection of pestivirus antibodies in swine[J]. Journal of Virological Methods, 2016, 235:15-20.

[28] Liu S, Tu C, Wang C,etal. The protective immune response induced by B cell epitope of classical swine fever virus glycoprotein E2[J]. Journal of Virological Methods, 2006, 134(1-2):125-129.

[29] Dong X N, Chen Y H. Candidate peptide-vaccines induced immunity against CSFV and identified sequential neutralizing determinants in antigenic domain A of glycoprotein E2[J]. Vaccine, 2006, 24(11):1 906-1 913.

[30] Monsó M, Tarradas J, De l T B G,etal. Peptide vaccine candidates against classical swine fever virus: T cell and neutralizing antibody responses of dendrimers displaying E2 and NS2-3 epitopes[J]. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society, 2011, 17(1):24.

[31] G X, Zhou Y J, Yu H,etal. A novel dendrimeric peptide induces high level neutralizing antibodies against classical swine fever virus in rabbits[J]. Veterinary Microbiology, 2012, 156(1-2):200-204.

[32] ka L G, Fernandezsainz I, Sanford B,etal. Development of an improved live attenuated antigenic marker CSF vaccine strain candidate with an increased genetic stability[J]. Virology, 2014, 471-473:13-18.

[33] linka L G, Fernandez-Sainz I, O'Donnell V,etal. Development of a live attenuated antigenic marker classical swine fever vaccine[J]. Virology, 2009, 384(1):106-113.

[34] Zhu S, Guo X, Keyes L R,etal. Recombinant Encephalomyocarditis Viruses Elicit Neutralizing Antibodies against PRRSV and CSFV in Mice[J]. Plos One, 2015, 10(6):e0129729.

[35] Zhang H, Qian P, Liu L,etal. Virus-like particles of chimeric recombinant porcine circovirus type 2 as antigen vehicle carrying foreign epitopes[J]. Viruses, 2014, 6(12):4 839.

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金項目(31372434)

孫永芳(1989-)，女，碩士生，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:17701023687@163.com

王琴，E-mail：wq551@vip.sina.com

S852.651

A

0529-6005(2017)07-0072-04