于 雪

（山東省德州市畜牧站，德州 253000）

奶水牛精原干細(xì)胞異種移植進(jìn)展

于 雪

（山東省德州市畜牧站，德州 253000）

中國(guó)是水牛數(shù)量居第二位的國(guó)家，與牛相比，水牛的基因改造尤其是遺傳進(jìn)展更依賴于新興動(dòng)物繁殖生物技術(shù)，特別是在干細(xì)胞領(lǐng)域，其中精原干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為水牛的遺傳改良帶來(lái)了廣闊的發(fā)展空間，而精原干細(xì)胞移植是檢測(cè)精原干細(xì)胞功能活性的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。本文對(duì)畜禽精原干細(xì)胞移植進(jìn)行了綜述，特別對(duì)近幾年奶水牛精原干細(xì)胞方面的研究進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。盡管跨物種的精原干細(xì)胞移植沒(méi)有提供直接的實(shí)際應(yīng)用，但是它是對(duì)分離得到的生殖細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞潛能評(píng)定的唯一生物模型，同時(shí)有利于探索雄性生殖系干細(xì)胞和睪丸生物學(xué)功能，以及雄性不育的潛在原因。

奶水牛；精原干細(xì)胞；異種；移植

奶水牛經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和進(jìn)化，形成了耐高溫、耐粗飼和抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠很好適應(yīng)我國(guó)南方飼草資源和氣候，而水牛奶也因其上佳的品質(zhì)和口感逐漸受到消費(fèi)者青睞，因此，奶水牛有極大的發(fā)展?jié)摿?。我?guó)水牛多為沼澤型水牛，與印度、巴基斯坦等河流型水牛相比，我國(guó)水牛繁殖力和產(chǎn)奶量均較低[1]。由于資金、疫情等條件限制，很難從國(guó)外大量引進(jìn)優(yōu)質(zhì)水牛。因此，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用水牛繁殖新技術(shù)顯得尤為重要，特別是在干細(xì)胞領(lǐng)域[2]。

在干細(xì)胞領(lǐng)域的繁殖新技術(shù)中，精原干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為奶水牛的遺傳改良帶來(lái)了廣闊的發(fā)展空間，在生殖細(xì)胞懸液中精原干細(xì)胞無(wú)法通過(guò)形態(tài)學(xué)分析與其他A型精原細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)，但精原干細(xì)胞是唯一一種既能自我更新又可向下分化形成精原細(xì)胞的干細(xì)胞，因此將其移植入缺失精原細(xì)胞的受體睪丸內(nèi)能夠定殖并重新填充睪丸，這也正是精原干細(xì)胞活性的功能測(cè)定方法[3]。該測(cè)定方法也用于研究精原干細(xì)胞分化相關(guān)的基因和調(diào)控因子[4]，此外，精原干細(xì)胞移植也是輔助生殖和體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的一個(gè)潛在的技術(shù)手段。研究證實(shí)利用該技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，不僅比利用胚胎干細(xì)胞制作轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的技術(shù)路線簡(jiǎn)單、成本低廉，還可以克服一些轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物未能解決的問(wèn)題[5]。

1 其他物種精原干細(xì)胞的移植基礎(chǔ)

1．1 移植前受體動(dòng)物的制備

成功移植的前提首先便是受體的制備，裸鼠因其缺乏內(nèi)源生殖細(xì)胞從而成為移植實(shí)驗(yàn)的理想選擇。然而，移植后裸鼠生產(chǎn)的F1代穩(wěn)定性存在質(zhì)疑[6]。因此，化學(xué)制劑如白消安則被廣泛應(yīng)用于受體小鼠的制備[7]。亞致死劑量的白消安有助于消除內(nèi)源精子發(fā)生但不會(huì)損傷曲細(xì)精管的微環(huán)境[8]。然而，它的作用劑量在不同物種間區(qū)別較大，因此需要針對(duì)特定物種在移植前進(jìn)行優(yōu)化。一般采用不同劑量的白消安肌肉注射受體動(dòng)物，并通過(guò)體重、曲細(xì)精管形態(tài)和激素分泌水平等因素綜合分析白消安對(duì)受體動(dòng)物的影響，適宜劑量需要完全消除曲細(xì)精管內(nèi)的精原細(xì)胞但又不破壞支持細(xì)胞及龕內(nèi)微環(huán)境，而且又不會(huì)對(duì)受體動(dòng)物的體重或激素水平造成不利影響，用以保證供體細(xì)胞在受體睪丸內(nèi)的正常增殖分化。

1．2 精原干細(xì)胞的同種移植

受體動(dòng)物制備技術(shù)的成熟便推動(dòng)了精原干細(xì)胞移植的研究，1994年Brinster和Avarbock首次將精原干細(xì)胞移植入不育小鼠并使之恢復(fù)生育能力，使得供體細(xì)胞在受體睪丸中獲得了精子發(fā)生并可將供體基因型傳遞到后代生殖系，由此發(fā)展了精原干細(xì)胞的功能檢測(cè)法[9]。目前，精原干細(xì)胞的鑒定多采用抗原表面標(biāo)記結(jié)合功能檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定。此后，生殖細(xì)胞同種移植已在大鼠、豬、山羊、犬等動(dòng)物上取得成功，在受體睪丸均可以定植形成克隆[10～12]，而在奶牛上自體移植是成功的，并且形成了完整的精子發(fā)生[13]。

1．3 精原干細(xì)胞的異種移植

Hamra于2002年將大鼠生精細(xì)胞移植到具有免疫缺陷的小鼠睪丸中，獲得了完整的生精過(guò)程[14]，此項(xiàng)研究的成功為今后該技術(shù)在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物上的應(yīng)用提供了參考。將來(lái)自其他物種（倉(cāng)鼠、兔、狗、狒狒、人）的睪丸細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠后，可見(jiàn)供體細(xì)胞在基底形成供體來(lái)源的克隆，但其分化不完整[15,16]。近年來(lái)異種移植在畜禽上也取得成功，但是移植效果好壞參半。在牛上的首次報(bào)道證實(shí)牛的供體生殖細(xì)胞在受體鼠睪丸中得以定植及增殖并存活長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月[17]。但不同的是，Oatley課題組研究表明供體細(xì)胞可以在受體睪丸中成功定植和增殖達(dá)80d，并進(jìn)一步得出小鼠模型可以用來(lái)評(píng)估精原干細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程[18]。在犬、馬、豬等異種移植研究中也得到了類似的結(jié)果[10,17]。但這些研究一致表明，異種移植的成功依賴于供體和受體物種之間的系統(tǒng)發(fā)育距離。

2 水牛精原干細(xì)胞的異種移植

2．1 水牛精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

而在水牛精原干細(xì)胞移植方面的研究較少，大部分研究集中在體外分離純化和培養(yǎng)。2012年Ahmad對(duì)水牛A型精原細(xì)胞的分離及純化程序進(jìn)行了優(yōu)化，以不同組份的消化酶進(jìn)行分離，使用特定的標(biāo)記加以純化，結(jié)果顯示A型精原細(xì)胞的比例達(dá)50%以上[19]。2012年廣西大學(xué)石德順課題組也先后對(duì)水牛類精原干細(xì)胞進(jìn)行了體外分離純化及短期培養(yǎng)，采用膠原酶、胰蛋白酶兩步酶消化法消化睪丸組織成功得到大量的睪丸細(xì)胞，再經(jīng)差異貼壁以及Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離純化得到A型精原細(xì)胞，細(xì)胞懸液體外培養(yǎng)2d后開(kāi)始增殖，10～20d左右形成類精原干細(xì)胞克隆，且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加血清及GDNF對(duì)精原細(xì)胞分裂增殖及克隆形成有促進(jìn)作用[20]。

2．2 水牛精原干細(xì)胞的異種移植

最終確定水牛SSCs移植成功與否，最關(guān)鍵的因素是確定受體睪丸組織內(nèi)供體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的存在。近期扁豆凝集素（DBA）已被鑒定得知是水牛精原干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[19]。2012年Mahla分離得到水牛的精原細(xì)胞懸液直接用于異種移植，于移植后30d收集受體鼠睪丸進(jìn)行DBA免疫組化證實(shí)并非全部的供體細(xì)胞均可定植，而且這部分定植細(xì)胞表現(xiàn)出POU5F1強(qiáng)陽(yáng)性，既建立了小鼠異種移植模型，也驗(yàn)證了分子標(biāo)記POU5F1的特異性[2]。這項(xiàng)研究極大地推動(dòng)了精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定，2014年楊利國(guó)課題組通過(guò)劑量?jī)?yōu)化后的白消安制備昆明小鼠受體，并通過(guò)異種移植將體外轉(zhuǎn)染的水牛精原干細(xì)胞注射入受體曲細(xì)精管，應(yīng)用DBA免疫組化和PCR方法檢測(cè)供體精原細(xì)胞的存在，發(fā)現(xiàn)水牛睪丸細(xì)胞作為新鮮的供體，在受體鼠的睪丸曲細(xì)精管中可見(jiàn)形成圓形的細(xì)胞克隆，但是2個(gè)月后，受體睪丸中克隆數(shù)減少，并且這些細(xì)胞表現(xiàn)為纖維組織細(xì)胞形態(tài)并失去了生精能力。研究結(jié)果顯示，用白消安處理的昆明小鼠睪丸能夠?qū)崿F(xiàn)水牛精原干細(xì)胞的克隆和增殖，從而使其成為合適的動(dòng)物模型用于評(píng)估供體細(xì)胞的干細(xì)胞潛能，且證實(shí)水牛精原干細(xì)胞在受體小鼠睪丸中可以存活并增殖達(dá)2個(gè)月[21]。

3 異種移植后供體源精子發(fā)生

迄今為止，僅限于與受體系統(tǒng)發(fā)育相近的物種能夠成功獲得供體來(lái)源的精子發(fā)生。除了小鼠對(duì)小鼠的同種移植，大鼠到小鼠[22]、倉(cāng)鼠到小鼠[23]以及小鼠到大鼠的異種移植都觀察到供體源精子發(fā)生。但是倉(cāng)鼠移植到受體小鼠后，獲得的倉(cāng)鼠精子形態(tài)上有缺陷，造成這一結(jié)果的主要原因是影響精子最終分化的是受體（小鼠）的支持細(xì)胞，而供受體物種又存在差異，因此供體精子在發(fā)育中出現(xiàn)形態(tài)學(xué)錯(cuò)誤。而在楊利國(guó)課題組的研究中，奶水牛精原干細(xì)胞在移植后一個(gè)月內(nèi)受體睪丸內(nèi)存在遷移和定植現(xiàn)象，之后一個(gè)月供體細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少，只是偶見(jiàn)體細(xì)胞形態(tài)的供體來(lái)源細(xì)胞，同樣說(shuō)明小鼠睪丸的支持細(xì)胞難以維持奶水牛精原干細(xì)胞的精子發(fā)生，類似的結(jié)果在牛對(duì)小鼠異種移植中也出現(xiàn)過(guò)[18]。

4 精原干細(xì)胞移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

由于精原干細(xì)胞（SSCs）是成年動(dòng)物體內(nèi)唯一具有自我更新潛能的干細(xì)胞，在雄性動(dòng)物整個(gè)的生命過(guò)程中不斷支持精子發(fā)生，因此在體外培養(yǎng)的同時(shí)若進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，待移植到內(nèi)源性精原細(xì)胞缺失的受體睪丸，含有目的基因的供體細(xì)胞便可在受體睪丸內(nèi)環(huán)境中獲得精子發(fā)生，通過(guò)人工授精產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)基因后代，從而使其成為一個(gè)潛在的新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

Brinster和Avarbock等最早開(kāi)展生殖細(xì)胞移植制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工作，該課題組于1994年將攜帶有l(wèi)ac-Z基因供體小鼠的睪丸混合懸浮液，利用顯微注射法移植入另一只不育受體小鼠的曲細(xì)精管內(nèi)。結(jié)果顯示供體SSCs獲得精子發(fā)生過(guò)程，并能產(chǎn)生形態(tài)特征正常的攜帶 lac-Z 基因的成熟精子細(xì)胞[9]。而之后2001年Nagano采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠睪丸細(xì)胞，同種移植后獲得了含目的基因的干細(xì)胞克隆，但由于轉(zhuǎn)染效率和繁殖率低未能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代[15]。然而隨后這個(gè)問(wèn)題得已解決，目前此項(xiàng)技術(shù)在嚙齒類模型動(dòng)物上的研究已經(jīng)很成熟，且已在多種物種包括大家畜上實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。Dobrinski 實(shí)驗(yàn)室[24]在2008年成功地利用腺病毒介導(dǎo)的方法直接將外源基因轉(zhuǎn)入山羊的精原干細(xì)胞內(nèi)，然后將精原干細(xì)胞移植進(jìn)事先經(jīng)過(guò)輻射處理的受體山羊睪丸并且產(chǎn)生了大量精子，再利用體外受精的方法，成功地監(jiān)測(cè)到10%的胚胎為轉(zhuǎn)基因胚胎，這進(jìn)一步證明了精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及移植在家畜等大型動(dòng)物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用上的可行性。

另外，人們還進(jìn)行了異種移植介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的嘗試，1999年Ogawa將攜帶有l(wèi)ac-Z基因的大鼠SSCs在體外進(jìn)行大量增殖后注入免疫缺陷的小鼠睪丸內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠SSCs也出現(xiàn)了生精的過(guò)程[25]。2014年，楊利國(guó)課題組成功地獲得了以PB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水牛精原干細(xì)胞，并經(jīng)異種移植到受體昆明種小鼠中，該移植模型證實(shí)了轉(zhuǎn)基因處理的SSCs仍具有增殖和分化潛能，這為今后通過(guò)同種移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛提供了理論和技術(shù)支持[21]。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，精原干細(xì)胞同種和異種移植技術(shù)為探索雄性生殖細(xì)胞系和睪丸功能及潛在影響雄性生育能力的原因提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)生物學(xué)方法。同種移植可以在家畜生殖細(xì)胞系的遺傳改良、珍稀動(dòng)物或者瀕危動(dòng)物繁殖力的保持提供應(yīng)用，盡管跨物種的精原干細(xì)胞移植礙于進(jìn)化距離的障礙，暫時(shí)沒(méi)有提供直接的實(shí)際應(yīng)用，但是它是對(duì)分離得到的生殖細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞潛能評(píng)定的生物模型[26]，同時(shí)也有利于探索雄性生殖系干細(xì)胞和睪丸生物學(xué)功能，以及雄性不育的潛在原因。而由兩者介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，例如與受精卵顯微注射法相比，降低了對(duì)技術(shù)和儀器的要求；與胚胎干細(xì)胞法相比，操作簡(jiǎn)單且材料來(lái)源廣泛；與精子載體法相比，精原干細(xì)胞可以增殖分化產(chǎn)生數(shù)量更多的轉(zhuǎn)基因后代。不過(guò)截至目前，通過(guò)精原干細(xì)胞移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物只在有限的種屬中實(shí)現(xiàn)，但相信隨著越來(lái)越多體外培養(yǎng)體系的建立，這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)策略將有不可估量的應(yīng)用價(jià)值。

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Progress of Xenotransplantation in Dairy Buffalo Spermatogonial Stem Cells

YU Xue
(Animal Husbandry Station of Dezhou, Dezhou 253000)

Chinese ranks second in the number of buffalo worldwide. Comparing with cattle, genetic modification especially genetic progress in buffalo is more dependent on the emerging animal reproduction biotechnology, especially in the field of stem cells. In which, spermatogonial stem cell mediated transgenic technology brought a broad space for genetic improvement of buffalo, and stem cell transplantation is an important technical means to detect the activity of spermatogonial stem cell function. This paper introduces the spermatogonial stem cell transplantation in livestock, emphasizing spermatogonial stem cell research in dairy buffalo in recent years. Although cross species spermatogonial stem cell transplantation provides no direct practical application, it is still the only biological model evaluation of stem cell potential for the isolated germ cells. It is also conducive to the exploration of male germline stem cells and testicular function, as well as the potential causes of male infertility.

Dairy buffalo; Spermatogonial stem cells; Cross species; Transplantation

S823.3

A

1004-4264（2017）05-0012-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.004

2016-12-08

于雪，女，博士，從事畜牧獸醫(yī)工作。