吳微，楊柳，徐翊

1.長江航運總醫(yī)院，湖北 武漢 430010；2.武漢大學醫(yī)院，湖北 武漢 430071；3.武漢市第六醫(yī)院，湖北 武漢 430015

槲皮素對轉化生長因子誘導人臍靜脈內皮細胞內皮-間質轉化的影響

吳微1，楊柳2，徐翊3

1.長江航運總醫(yī)院，湖北 武漢 430010；2.武漢大學醫(yī)院，湖北 武漢 430071；3.武漢市第六醫(yī)院，湖北 武漢 430015

目的觀察槲皮素對轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）-12內皮-間質轉化的影響，探討其作用機制。方法CCK-8法檢測不同濃度槲皮素和/或TGF-β1干預HUVEC-12 72 h后細胞活力；RT-PCR和免疫熒光雙染檢測內皮及間質標記物的轉變；Western blot檢測信號通路；RT-PCR檢測在轉變過程中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用的轉錄因子。結果RT-PCR和免疫熒光雙染結果均提示，TGF-β1（10 ng/mL）連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導其轉化為成纖維細胞表型，表現(xiàn)出更多的間質標記物升高，內皮標記物降低；Western blot和RT-PCR結果顯示，槲皮素呈濃度依賴性抑制smad2/3的磷酸化；TGF-β1刺激后，下游調控內皮-間質轉化的重要轉錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明顯升高，而100 μmol/L槲皮素則可顯著下調下游的5種轉錄因子。結論槲皮素可抑制TGF-β1誘導的HUVEC-12發(fā)生內皮-間質轉化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

槲皮素；內皮-間質轉化；臍靜脈內皮細胞；纖維化

心室重構過程中會發(fā)生心肌間質纖維化，而間質纖維化的主要特點為細胞外基質過度沉積和間質細胞如肌成纖維細胞的增殖，進而導致心肌組織毛細血管密度降低，心室順應性也降低，最終心肌順應性下降，導致心力衰竭。研究顯示，抗纖維化治療可明顯改善心力衰竭患者預后，在心肌纖維化進程中，除固有的成纖維細胞會發(fā)生活化增殖外，內皮細胞、上皮細胞、單核細胞、循環(huán)纖維細胞等均可通過一定機制轉化為成纖維細胞，抑制內皮-間質轉化可顯著改善心室重構及心功能[1-2]。

槲皮素及其衍生物分布廣泛，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、保護心血管功能以及抗病毒的作用[3]，具有抑制成纖維細胞增殖、抑制膠原合成、阻止氧化損傷、抑制血管生成等抗纖維化作用[4-5]。本實驗觀察槲皮素對轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）-12內皮-間質轉化的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

槲皮素，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥99％，貨號117-39-5。

1.2 細胞

HUVEC-12，YRGene（NC006）。37 ℃、5.0％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當細胞密度鋪滿80％培養(yǎng)皿底時，采用0.25％胰酶消化后進行傳代。對細胞采取刺激前，將培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco； CCK-8檢測試劑盒，日本同仁化學研究所；RT-PCR試劑盒，Roche；TGF-β1，PEPROTECH公司；ECGS，ScienCell公司；CD31、vimentin抗體，ABCAM公司；p-smad2、p-smad3、GAPDH，Cell Signaling Technology公司；smad2、smad3，Santa Curz公司；引物由上海生工合成。多功能微孔板檢測系統(tǒng)Synergy HT（美國BioTek），恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO），紫外分光光度計NANODROP 2000c（Thermo scientific），RT反轉錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems），實時定量PCR儀Light Lycler 480（美國Roche），倒置相差顯微鏡DP72（日本OLYMPUS）。

2 實驗方法

2.1 細胞處理及分組

待HUVEC細胞生長密度達60％時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，4 h后置換為含TGF-β1（10 ng/mL）無血清培養(yǎng)基，置于溫箱培養(yǎng)，12 h換液1次，72 h后收取蛋白質和RNA樣本。實驗分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1＋槲皮素10 μmol/L組、TGF-β1＋槲皮素50 μmol/L組、TGF-β1＋槲皮素100 μmol/L組、槲皮素100 μmol/L組。

2.2 細胞毒性試驗

細胞被接種至96孔板中，每孔100 μL，密度為2×105個/mL，置于溫箱培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基饑餓6 h，干預72 h，將96孔板中培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8無血清培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育2～2.5 h，于酶標儀波長450 nm處測定光密度（OD）值。

2.3 RT-PCR檢測

細胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度法測定其含量與純度。取大約5 μL總RNA反轉錄為cDNA。以GAPDH為內參，應用20 μL體系進行PCR擴增。反應條件：94 ℃、2 min，1個循環(huán)；94 ℃、40 s，25～35個循環(huán)；50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、5 min，1個循環(huán)。

2.4 Western blot檢測

細胞裂解液冰上裂解細胞10 min，手機并提取蛋白。校正GAPDH后，每組以校正后體積進行10％SDS-PAGE凝膠電泳，后將蛋白以100 V、90 min轉移至PVDF膜上，用一抗封閉液（1∶1000）進行封閉，然后用TBST洗膜，一抗孵育過夜后加入相對應的二抗（1∶5000）行顯色反應。應用Odyssey圖像分析軟件檢測各組蛋白的相對密度值作為蛋白表達水平，均以GAPDH作為內參。

2.5 免疫熒光雙染檢測

干預結束后，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，再以0.2％Triton通透細胞5 min，PBS漂洗3次，細胞爬片滴加25 μL 8％新生胎牛血清，置于濕盒內，置于37 ℃溫箱中孵育1 h，濾紙將封閉液吸干，滴加含有CD31/vimentin的一抗稀液（1∶200），置于4 ℃冰箱過夜，將濕盒取出置于37 ℃溫箱復溫1 h，將細胞爬片從24孔中取出，置于防脫切片上，滴加含有2種不同顏色的二抗（1∶2000），室溫下避光孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI封片置于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 槲皮素對人臍靜脈內皮細胞-12細胞活力的影響

干預72 h后，10、50、100 μmol/L槲皮素及其與TGF-β1的混合液對HUVEC-12細胞活力與未加任何處理因素的對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

4.2 槲皮素對轉化生長因子-β1誘導的人臍靜脈內皮細胞-12發(fā)生內皮-間質轉化的影響

槲皮素（10、50、100 μmol/L）與TGF-β1協(xié)同刺激HUVEC-12 72 h呈濃度依賴性抑制Ⅰ型膠原蛋

圖4 各組HUVEC-12 smads信號通路蛋白表達免疫印跡電泳圖

表4 各組HUVEC-12 smads信號通路蛋白表達比較（±s，OD值）

表4 各組HUVEC-12 smads信號通路蛋白表達比較（±s，OD值）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1組比較，#P＜0.05

組別 劑量/（μmol/L） p-smad2 p-smad3對照組 1.00±0.07 1.00±0.08 TGF-β1組 2.55±0.26*2.53±0.25*TGF-β1＋槲皮素組 10 2.14±0.19#1.92±0.18#TGF-β1＋槲皮素組 50 1.64±0.18#1.54±0.15#TGF-β1＋槲皮素組 100 1.26±0.19#1.19±0.09#槲皮素組 100 1.04±0.07 0.99±0.05

表5 各組HUVEC-12重要轉錄因子mRNA表達比較（±s）

表5 各組HUVEC-12重要轉錄因子mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1組比較，#P＜0.05

組別 劑量/（μmol/L） snail1 twist1 twist2 ZEB1 ZEB2對照組 1.00±0.10 1.00±0.11 1.00±0.08 1.00±0.09 1.00±0.11 TGF-β1組 1.78±0.28*3.11±0.41*3.99±0.36*3.02±0.37*3.10±0.25*TGF-β1＋槲皮素組 100 1.21±0.18#1.96±0.19#1.89±0.25#1.67±0.19#1.78±0.14#槲皮素組 100 1.03±0.09 1.04±0.06 0.98±0.08 0.99±0.10 1.07±0.18

5 討論

內皮細胞通過內皮-間質轉化機制轉化的成纖維細胞在心肌纖維化中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導其轉化為成纖維細胞表型，表現(xiàn)出更多的間質標記物升高，而內皮標記物降低。Western blot結果顯示，槲皮素可能通過抑制TGF-β1/Smads信號通路以及其下游的轉錄因子發(fā)揮抑制內皮-間質轉化作用。以上結果均提示，槲皮素可抑制TGF-β1誘導的HUVEC-12發(fā)生內皮-間質轉化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

上皮-間質轉化是上皮細胞失去上皮特性獲得間質細胞表型的一種生物現(xiàn)象，發(fā)生上皮-間質轉化后細胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標記基因表達降低，vimentin、fibronectin、N-鈣黏蛋白等間質標記基因表達升高。研究表明，上皮-間質轉化參與腫瘤侵襲轉移，在腫瘤轉移過程中，癌細胞通過上皮-間質轉化而獲得間質細胞表型和侵襲性，實現(xiàn)對周圍組織的浸潤，在種植部位，癌細胞通過間質-上皮細胞轉化最終形成與原發(fā)灶形態(tài)結構相似的轉移灶，內皮-間質轉化是上皮-間質轉化的一種形式，近年來，隨著對器官纖維化發(fā)生發(fā)展機制的研究逐步深入，內皮-間質轉化逐漸受到研究者的關注[6]。在器官纖維化進展到一定階段時，小血管內皮細胞會逐漸轉變?yōu)楹铣珊头置诠δ芑钴S的成纖維細胞，再進一步轉化為肌成纖維細胞，完成內皮-間質轉化的轉變。Zeisberg E M等[2]于2007年首次發(fā)現(xiàn)在壓力負荷誘導的小鼠心肌纖維化中，內皮細胞通過內皮-間質轉化現(xiàn)象轉變?yōu)槌衫w維細胞，對心肌纖維化起到一定的促進作用，抑制內皮-間質轉化則可顯著改善心肌功能，表明內皮-間質轉化對心肌纖維化具有重要作用。

本研究以TGF-β1誘導的HUVEC-12建立內皮-間質轉化模型，明確間質微環(huán)境在內皮細胞內皮-間質轉化中的作用，明確內皮-間質轉化過程與信號通路之間關系，采用10 ng/mL TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h，細胞形態(tài)由鋪路石樣轉化為狹長形的成纖維細胞性狀，細胞之間的連接也從緊密連接轉換為松散連接，細胞間縫隙增大，RT-PCR檢測結果顯示，間質標記物Collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、fibronectin均表達上調，而內皮細胞標記物CD31則表達下調，由此可以判斷TGF-β1可誘導HUVEC-12發(fā)生內皮-間質轉化，而TGF-β1與槲皮素同時干預HUVEC-12 72 h則可呈濃度依賴性逆轉內皮-間質轉化現(xiàn)象，上調內皮細胞標記物，下調間質標記物，免疫熒光雙染結果也得到同樣結果。內皮-間質轉化是內皮細胞來源的內皮細胞獲得具有遷移和侵襲能力間質細胞的重要生物學過程。因而，闡明調控內皮細胞發(fā)生內皮-間質轉化過程的分子機制，明確其在心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的病理意義，并探索基于內皮-間質轉化關鍵分子的診斷方法及靶向內皮-間質轉化關鍵分子的治療手段是心肌纖維化中內皮-間質轉化機制研究的關鍵問題。

TGF-β1/Smads信號通路及其下游的一些轉錄因子在心臟內皮-間質轉化中發(fā)揮著重要的調控作用，這些包括snail和twist鋅指轉錄因子家族成員以及ZEB家族[7-9]。本研究檢測了TGF-β1/smads信號通路及其下游的靶分子的表達，包括snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2，結果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激HUVEC-12 24 h可顯著引起smad信號通路的磷酸化水平升高，其下游的靶分子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均表達上調，而TGF-β1與槲皮素（100 μmol/L）聯(lián)合作用時，則可顯著降低smad信號通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我們認為槲皮素可能通過抑制TGF-β1/smads信號通路以及其下游的靶分子表達抑制HUVEC-12發(fā)生內皮-間質轉化現(xiàn)象。

槲皮素作用機制復雜，幾乎涉及組織器官纖維化的各個環(huán)節(jié)：①抑制成纖維細胞增殖；②抑制膠原合成；③抗氧化損傷；④抑制內皮細胞生長，抑制血管形成；⑤影響細胞周期，誘導細胞凋亡。本研究結果表明，槲皮素可抑制TGF-β1誘導的HUVEC-12發(fā)生內皮-間質轉化環(huán)節(jié)，為進一步探討槲皮素的臨床治療提供了實驗依據(jù)。此外，本研究也探討了槲皮素對內皮-間質轉化的作用并鑒定其可能作用的信號通路及轉錄因子，但未能闡明其具體的作用機制，也未能在大體動物模型中進一步驗證，有待進一步完善相關實驗，明確其作用機制。

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（修回日期：2016-03-26；編輯：華強）

Effects of Quercetin on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Undergoing Endothelial-to-mesenchymal Transition Induced by TGF-β1

WU Wei1, YANG Liu2, XU Yi3
(1. General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, China; 2. The Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 3. Sixth Hospital of Wuhan, Wuhan 430015, China)

ObjectiveTo investigate the effectsof quercetin on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)-12 undergoing endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) induced by TGF-β1; To discuss its mechanism of action.MethodsCell activity of intervening by quercetin with different concentrations and TGF-β1 for 72 h was detected by CCK-8 method; RT-PCR and immunofluorescence staining were used to detect the transition of endothelial and stromal markers; Western blot was used to detect the signal transduction pathway; RT-PCR was performed to detect the transcription factors that play crucial roles in the process of transformation.ResultsThe results of RT-PCR and immunofluorescence double staining showed that TGF-β1 (10 ng/mL) stimulated HUVEC-12 cells for 72 h to induce fibroblast phenotype, showing more interstitial markers and less endothelial markers; Western blot and RT-PCR results showed that quercetin inhibited the phosphorylation of smad2/3 in a concentration-dependent manner; After TGF-β1 stimulation, the downstream transcription factors EndMT of snail1, twist1, twist2, ZEB1, and ZEB2 significantly increased, while 100 μmol/L quercetin could down-regulate the five downstream transcription factors.ConclusionQuercetin has anti-fibrosis effects through inhibiting HUVEC-12 cells undergoing EndMT.

quercetin; endothelial-to-mesenchymal transition; umbilical vein endothelial cell; fibrosis

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0065-05

2016-03-01）

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017