楊艷 ，王仁嬡 ，吳萍 ，黃寧斌 ，尚虎虎 ，馬錫玲

視網膜靜脈阻塞 （retinal vein occlusion,RVO）是高原地區(qū)常見眼底疾病，屬中醫(yī)“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數患者，又兼有氣虛的表現[1]，從中醫(yī)理論角度研究低氧環(huán)境對機體的影響是一項重要的研究課題。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和內皮素-1（endothelin-1,ET-1）均為血管活性物質，在調節(jié)血管舒縮及血管重建中起重要作用，已日益被人們所重視。本課題通過對不同海拔環(huán)境下氣虛血瘀證RVO患者VEGF以及ET-1的檢測，研究其表達水平的變化及差異，探討高原氣虛血瘀的本質，為以后更加深入的研究高原氣虛血瘀證打下基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年1月—2015年1月，經青海大學附屬醫(yī)院眼科門診或病房收集確診為氣虛血瘀證的單眼RVO患者60例，分屬于兩個不同的海拔地區(qū)。西寧地區(qū) （平均海拔2000 m）RVO患者30例，男性16例，女性14例；年齡最小41歲，最大75歲，平均（56±1.2） 歲；CRVO 19 例，BRVO 11 例； 缺血型 12例，非缺血型18例；合并有高血壓病者15例。格爾木市（平均海拔2800 m，患者居住地在海拔3000 m以上）選取RVO患者30例，男性21例，女性9例；年齡最小 45 歲，最大 81 歲，平均（51±2.3）歲；CRVO 13例，BRVO 17例；缺血型16例，非缺血型14例；合并有高血壓者19人。同期收集西寧地區(qū)及格爾木市的正常人各30例。所有被納入者均為世居人群，經門診或住院確診。研究方案已通過醫(yī)學倫理委員會批準，對所有受試者均進行知情同意并簽署知情同意書。

RVO診斷標準 參照人民衛(wèi)生出版社出版的十二五規(guī)劃教材《眼科學》[2]中的診斷標準。（1）視力減退，或眼前黑影飄動；（2）眼底檢查，視網膜靜脈擴張迂曲，視網膜表層火焰狀或片狀出血，棉絨斑，水腫，絮狀滲出，或伴有玻璃體積血、黃斑水腫等；（3）熒光素眼底血管造影（FFA）：視網膜靜脈充盈時間延遲，管壁滲漏，并出現視網膜毛細血管缺血無灌注區(qū)。

氣虛血瘀證標準 參照普通高等教育中醫(yī)藥類十二五行業(yè)規(guī)劃教材《中西醫(yī)結合眼科學》[1]相關內容制定。面色淡白或晦滯，身倦乏力，氣少懶言，疼痛如刺，常見于胸脅，痛處不移，拒按，舌淡暗或有紫斑，脈沉澀。

氣虛血瘀證RVO納入標準 （1）同時符合RVO診斷標準以及氣虛血瘀證辨證標準；（2）當地世居人群，單眼首次發(fā)病，年齡不限。

氣虛血瘀證RVO排除標準 （1）妊娠或哺乳期婦女；（2）心、肝、腎功能明顯異常者，或惡性腫瘤患者；（3）青光眼，糖尿病視網膜病變（DR），葡萄膜炎，視網膜脫離等疾病患者。

正常人納入標準 當地世居人群，眼底正常。

正常人排除標準 新入高原的外來人口。

1.2 觀察指標

血清ET-1：住院患者于入院后次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml，門診患者于診斷清楚后次日清晨空腹抽取靜脈血5ml。乙二胺四乙酸鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，取血清置于EP管中，-20℃冰箱保存待測。檢測前室溫下復溫，所有標本均凍融一次。酶聯(lián)免疫吸附試驗法 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測ET-1，用純化的人ET-1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ET-1，再與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的羊抗人抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ET-1呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中人ET-1濃度。

血清VEGF：取血方法同上，ELISA法檢測血清VEGF。

試驗儀器：低溫冰箱（-80℃），TG16-WS高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），恒溫箱（上海一恒科學儀器有限公司），酶標定量測定儀（深圳雷杜生命科學有限公司），游標卡尺（桂林可立德量器有限公司）。ELISA試劑盒（北京久峰潤達生物技術有限公司提供）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以xˉ±s表示，不同人群組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在西寧以及格爾木地區(qū)，RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF水平均明顯高于本地區(qū)的正常組（P＜0.05）。不同地區(qū)間比較，格爾木地區(qū)RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF數值高于西寧地區(qū)患者（P＜0.05），兩地區(qū)正常組間的 ET-1、VEGF 水平則均無明顯差異（P＞0.05），具體見表 1、表 2。 RVO 氣虛血瘀證者ET-1、VEGF水平的普遍升高，以及該兩項指標數值隨海拔升高而增加的結果，提示外環(huán)境低氧參與了氣虛血瘀證視網膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧。

3 討論

外環(huán)境低氧損傷是高原醫(yī)學、航天醫(yī)學等學科領域面臨的共性問題，高原氣虛證系由外環(huán)境低氧引發(fā)并且具有較典型氣虛證的病理改變和臨床表現的一種中醫(yī)證型，由氣虛導致血瘀是許多高原常見疾病發(fā)病的病理機制[4]。RVO是高原地區(qū)常見眼底疾病，屬中醫(yī)“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數患者，又兼有氣虛的表現[1]。從中醫(yī)角度研究外環(huán)境低氧對機體的影響是一項重要的研究課題。

表1 不同海拔地區(qū)RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 ET-1 比較（xˉ±s，ng/l）

表2 不同海拔地區(qū)RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 VEGF 比較（xˉ±s，pg/ml）

ET-1是血管內皮損傷的分子標志物之一[5]。內皮損傷是增加ET-l釋放的重要機制，有研究發(fā)現低氧能以時間依賴的方式誘導微血管周細胞ET-l的分泌，缺氧狀態(tài)下，血管內皮細胞生成各種活性物質的比例失衡，ET-1的產生增加，內皮細胞凋亡亦增加。視網膜靜脈阻塞后由于靜脈血管的栓塞，導致了局部的缺血缺氧，誘導ET-1升高[6]。VEGF是多功能的細胞因子，是生理條件下和病理生理適應過程中血管生長的主要調節(jié)因子[7]，缺血缺氧是該因子表達的強烈誘導因素。研究顯示，血栓在動靜脈交叉或篩板處形成后，可使視網膜發(fā)生缺氧，視網膜毛細血管在結構和功能上隨即發(fā)生改變，血-視網膜屏障發(fā)生破壞使大分子物質和離子等從毛細血管進入視網膜組織，從而發(fā)生視網膜水腫，視網膜缺氧缺血時，可誘發(fā)VEGF表達增加，血管通透性增加，黃斑水腫形成。

本研究中發(fā)現，同一海拔人群，患病人群的ET-1及VEGF的表達明顯升高，提示視網膜靜脈阻塞氣虛血瘀證的ET-1及VEGF的表達確實產生增加，參與了血管病變的發(fā)生；不同海拔正常人群ET-1及VEGF的水平未見統(tǒng)計學意義的差異，但是在患病人群中，高海拔地區(qū)者ET-1及VEGF的表達明顯升高，這也從另外一個側面提示外環(huán)境低氧參與了氣虛血瘀證視網膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧，從而誘導高表達。

高原低氧、低氣壓、寒冷的自然環(huán)境造成了生活在高原的人群身體狀況、疾病特點等方面都與平原地區(qū)的人群有很大差別[8]。高原低氧環(huán)境對人體臟腑功能、能量物質代謝等諸多方面具有廣泛的影響[9]。“氣為血之帥，血為氣之母。”氣旺，則可推動血液運行周身；若氣虛，則氣不行血，導致血瘀。氣虛血瘀證的病機是氣虛為本，在先；血瘀是標，生于后。高原氣虛血瘀證是指由于高原地區(qū)空氣稀薄，清氣化源不足，宗氣匱乏，不能助肺以行呼吸，貫心脈，導致人體機能下降，加之高原寒冷的氣候特點，易使血液出現“濃、黏、稠、聚”等氣虛血瘀證的表現。高原寒冷可使血流緩慢，進一步加重缺氧，使氣虛血瘀證更加嚴重，從而形成具有高原特點的“氣虛血瘀證”[10]。ET-1及VEGF的水平與視網膜靜脈阻塞的范圍以及程度有沒有直接關系，在靜脈阻塞的不同階段如何變化，另外其他證型有無如此的表現，外周血的水平與視網膜組織中的表達有無差異都值得進一步探索。因而，深入探討微血管變化的調控機制成為尋找阻塞后改善微循環(huán)障礙的切人點，這些對于深入研究高原疾病以及對于中醫(yī)在高原病領域的探究意義重大。